Εξάρτηση του ρυθμού των ενζυματικών αντιδράσεων από τη συγκέντρωση των υποστρωμάτων, των ενζύμων και της θερμοκρασίας. Από τι εξαρτάται η ενζυμική δραστηριότητα; Εξίσωση Ρυθμού Αντίδρασης Ενζύμου

ΕΡΓΑΣΙΑ ΜΑΘΗΜΑΤΟΣ

Κινητική ενζυματικών αντιδράσεων

Εισαγωγή

Η βάση της δραστηριότητας ζωής οποιουδήποτε οργανισμού είναι οι χημικές διεργασίες. Σχεδόν όλες οι αντιδράσεις σε έναν ζωντανό οργανισμό συμβαίνουν με τη συμμετοχή φυσικών βιοκαταλυτών – ενζύμων.

Ο Berzelius το 1835 ήταν ο πρώτος που πρότεινε ότι οι αντιδράσεις ενός ζωντανού οργανισμού πραγματοποιούνται χάρη σε μια νέα δύναμη, την οποία ονόμασε «καταλυτική». Βάσισε αυτή την ιδέα κυρίως στην πειραματική παρατήρηση ότι η διαστάση από τις πατάτες υδρολύει το άμυλο πιο γρήγορα από το θειικό οξύ. Ήδη το 1878, ο Kuhne αποκάλεσε ένζυμο μια ουσία που έχει καταλυτική δύναμη σε έναν ζωντανό οργανισμό.

Η κινητική της δράσης του ενζύμου είναι ένας κλάδος της ενζυμολογίας που μελετά την εξάρτηση του ρυθμού αντίδρασης που καταλύεται από τα ένζυμα από τη χημική φύση και τις συνθήκες αλληλεπίδρασης του υποστρώματος με το ένζυμο, καθώς και από περιβαλλοντικούς παράγοντες. Με άλλα λόγια, η ενζυμική κινητική μας επιτρέπει να κατανοήσουμε τη φύση των μοριακών μηχανισμών δράσης των παραγόντων που επηρεάζουν τον ρυθμό της ενζυματικής κατάλυσης. Αυτό το τμήμα σχηματίστηκε στη διασταύρωση επιστημών όπως η βιοχημεία, η φυσική και τα μαθηματικά. Η πρώτη προσπάθεια να περιγραφούν μαθηματικά οι ενζυμικές αντιδράσεις έγινε από τον Duclos το 1898.

Στην πραγματικότητα, αυτή η ενότητα για τη μελέτη των ενζύμων είναι πολύ σημαντική στην εποχή μας, δηλαδή για την πρακτική ιατρική. Δίνει στους φαρμακολόγους ένα εργαλείο για στοχευμένες αλλαγές στον κυτταρικό μεταβολισμό, έναν τεράστιο αριθμό φαρμακευτικών προϊόντων και διάφορα δηλητήρια - αυτά είναι αναστολείς ενζύμων.

Ο σκοπός αυτής της εργασίας είναι να εξετάσει την εξάρτηση του ρυθμού αντίδρασης από διάφορους παράγοντες, πώς μπορεί να ελεγχθεί ο ρυθμός αντίδρασης και πώς μπορεί να προσδιοριστεί.

1. Κινητική Michaelis-Menten

Προκαταρκτικά πειράματα που μελετούν την κινητική των ενζυματικών αντιδράσεων έχουν δείξει ότι ο ρυθμός αντίδρασης, αντίθετα με τις θεωρητικές προσδοκίες, δεν εξαρτάται από τη συγκέντρωση του ενζύμου (Ε) και του υποστρώματος (S) με τον ίδιο τρόπο όπως στην περίπτωση ενός συμβατικού δεύτερου παραγγελία αντίδρασης.

Ο Brown και, ανεξάρτητα από αυτόν, ο Henri υπέθεσαν για πρώτη φορά τον σχηματισμό ενός συμπλόκου ενζύμου-υποστρώματος κατά τη διάρκεια της αντίδρασης. Αυτή η υπόθεση επιβεβαιώθηκε στη συνέχεια από τρία πειραματικά γεγονότα:

α) η παπαΐνη σχημάτισε μια αδιάλυτη ένωση με ινώδες (Wurtz, 1880).

β) το υπόστρωμα ινβερτάσης σακχαρόζη θα μπορούσε να προστατεύσει το ένζυμο από τη θερμική μετουσίωση (O" Sullivan and Thompson, 1890).

γ) τα ένζυμα αποδείχθηκε ότι είναι στερεοχημικά ειδικοί καταλύτες (Fisher, 1898-1899).

Εισήγαγαν την έννοια της μέγιστης ταχύτητας και το έδειξαν καμπύλη κορεσμού(δηλαδή, η εξάρτηση του ρυθμού αντίδρασης από τη συγκέντρωση του υποστρώματος) είναι μια ισόπλευρη υπερβολή. Απέδειξαν ότι η μέγιστη παρατηρούμενη ταχύτητα είναι μία από τις ασύμπτωτες προς την καμπύλη και το τμήμα που κόβεται στον άξονα της τετμημένης (στην περιοχή των αρνητικών τιμών του) από τη δεύτερη ασύμπτωτη, δηλ. σταθερή στην εξίσωση ταχύτητας, ίση σε απόλυτη τιμή με τη συγκέντρωση του υποστρώματος που απαιτείται για να επιτευχθεί η μισή μέγιστη ταχύτητα.

Οι Michaelis και Menten πρότειναν ότι ο ρυθμός αντίδρασης καθορίζεται από τη διάσπαση του συμπλόκου ES, δηλ. σταθερά k 2 . Αυτό είναι δυνατό μόνο εάν k 2 - η μικρότερη από τις σταθερές ρυθμού. Σε αυτή την περίπτωση, η ισορροπία μεταξύ του συμπλόκου ενζύμου-υποστρώματος, του ελεύθερου ενζύμου και του υποστρώματος επιτυγχάνεται γρήγορα σε σύγκριση με τον ρυθμό της αντίδρασης (ταχεία ισορροπία).

Ο αρχικός ρυθμός αντίδρασης μπορεί να εκφραστεί με τον ακόλουθο τύπο:

v = k 2

Εφόσον η σταθερά διάστασης του συμπλόκου ενζύμου-υποστρώματος είναι ίση με

K S = [E] [S] / = k -1 /k 1

τότε η συγκέντρωση του ελεύθερου ενζύμου μπορεί να εκφραστεί ως

[E] =K S / [S]

Η συνολική συγκέντρωση ενζύμου στο μίγμα της αντίδρασης προσδιορίζεται από τον τύπο

[E] t = [E] + [ES] = K S [ES] / [S] + [ES]

Η αντίδραση φθάνει στη μέγιστη ταχύτητα όταν η συγκέντρωση του υποστρώματος είναι αρκετά υψηλή ώστε όλα τα μόρια του ενζύμου να είναι παρόντα με τη μορφή συμπλόκου ES (άπειρα μεγάλη περίσσεια υποστρώματος). Η αναλογία της αρχικής ταχύτητας προς τη θεωρητικά πιθανή μέγιστη ταχύτητα είναι ίση με την αναλογία [ES] προς [E] t:

v / V max = / [E] t = / (K S / [S] + ) = 1 / (K S + [S] +1)

Αυτή είναι η κλασική εξίσωση ΜιχαηλήςΚαι Menten,η οποία, από τη δημοσίευσή της το 1913, έγινε η θεμελιώδης αρχή όλων των ενζυμοκινητικών μελετών για δεκαετίες και, με ορισμένους περιορισμούς, παραμένει μέχρι σήμερα.

Αργότερα αποδείχθηκε ότι η αρχική εξίσωση Michaelis-Menten είχε αρκετούς περιορισμούς. Είναι δίκαιο, δηλ. περιγράφει σωστά την κινητική μιας αντίδρασης που καταλύεται από ένα δεδομένο ένζυμο μόνο εάν πληρούνται όλες οι ακόλουθες περιοριστικές συνθήκες:

) σχηματίζεται ένα κινητικά σταθερό σύμπλοκο ενζύμου-υποστρώματος.

) σταθερά K S είναι η σταθερά διάστασης του συμπλόκου ενζύμου-υποστρώματος: αυτό ισχύει μόνο εάν ;

) η συγκέντρωση του υποστρώματος δεν αλλάζει κατά την αντίδραση, δηλ. η συγκέντρωση του ελεύθερου υποστρώματος είναι ίση με την αρχική του συγκέντρωση.

) το προϊόν της αντίδρασης αποσπάται γρήγορα από το ένζυμο, δηλ. δεν σχηματίζεται κινητικά σημαντική ποσότητα συμπλόκου ES.

) το δεύτερο στάδιο της αντίδρασης είναι μη αναστρέψιμο. Πιο συγκεκριμένα, λαμβάνουμε υπόψη μόνο την αρχική ταχύτητα, όταν η αντίστροφη αντίδραση (λόγω της πραγματικής απουσίας προϊόντος) μπορεί ακόμα να παραμεληθεί.

) μόνο ένα μόριο υποστρώματος συνδέεται σε κάθε ενεργό σημείο του ενζύμου.

) για όλες τις αντιδρώντες ουσίες, οι συγκεντρώσεις τους μπορούν να χρησιμοποιηθούν αντί για δραστηριότητες.

Η εξίσωση Michaelis-Menten χρησιμεύει ως το σημείο εκκίνησης για οποιαδήποτε ποσοτική περιγραφή της δράσης του ενζύμου. Θα πρέπει να τονιστεί ότι η κινητική συμπεριφορά των περισσότερων ενζύμων είναι πολύ πιο σύνθετη από αυτή που υπονοείται από το εξιδανικευμένο σχήμα που βρίσκεται κάτω από την εξίσωση Michaelis-Menten. Η εξαγωγή αυτής της εξίσωσης προϋποθέτει ότι υπάρχει μόνο ένα σύμπλοκο ενζύμου-υποστρώματος. Εν τω μεταξύ, στην πραγματικότητα, στις περισσότερες ενζυμικές αντιδράσεις, σχηματίζονται τουλάχιστον δύο ή τρία τέτοια σύμπλοκα, που συμβαίνουν σε μια ορισμένη αλληλουχία.

Εδώ το EZ υποδηλώνει το σύμπλοκο που αντιστοιχεί στην πραγματική μεταβατική κατάσταση και το EP υποδηλώνει το σύμπλοκο μεταξύ του ενζύμου και του προϊόντος αντίδρασης. Μπορεί επίσης να επισημανθεί ότι στις περισσότερες ενζυμικές αντιδράσεις εμπλέκονται περισσότερα από ένα υπόστρωμα και, κατά συνέπεια, σχηματίζονται δύο ή περισσότερα προϊόντα. Στην αντίδραση με δύο υποστρώματα, S 1 και S 2, μπορούν να σχηματιστούν τρία σύμπλοκα ενζύμου-υποστρώματος, δηλαδή ES 1, ES 2 και ES 1 S 2. Εάν η αντίδραση παράγει δύο προϊόντα, Ρ 1 και Ρ 2 , τότε μπορεί να υπάρχουν τουλάχιστον τρία επιπλέον σύμπλοκα ΕΡ 1 , ΕΡ 2 και ΕΡ 1 Ρ 2 . Σε τέτοιες αντιδράσεις υπάρχουν πολλά ενδιάμεσα στάδια, καθένα από τα οποία χαρακτηρίζεται από τη δική του σταθερά ρυθμού. Η κινητική ανάλυση των ενζυματικών αντιδράσεων που περιλαμβάνουν δύο ή περισσότερα αντιδρώντα είναι συχνά εξαιρετικά περίπλοκη και απαιτεί τη χρήση ηλεκτρονικών υπολογιστών. Ωστόσο, κατά την ανάλυση της κινητικής όλων των ενζυματικών αντιδράσεων, το σημείο εκκίνησης είναι πάντα η εξίσωση Michaelis-Menten που συζητήθηκε παραπάνω.

1.1 Φύση της σταθεράςκστην εξίσωση

εξίσωση κινητική ενζυματικής αντίδρασης

Το δεύτερο αξίωμα δηλώνει ότι η σταθερά K S στην εξίσωση είναι η σταθερά διάστασης του συμπλόκου ενζύμου-υποστρώματος.

Οι Briggs και Haldane απέδειξαν το 1925 ότι η αρχική εξίσωση Michaelis-Menten ισχύει μόνο για , δηλ. όταν η ισορροπία του στοιχειώδους σταδίου E+S ES εδραιωθεί πολύ γρήγορα σε σύγκριση με την ταχύτητα του επόμενου σταδίου. Επομένως, τέτοιοι κινητικοί μηχανισμοί (υπόκεινται στην αρχική συνθήκη Michaelis-Menten και έχουν ένα αργό στοιχειώδες στάδιο, σε σχέση με το οποίο οι ισορροπίες σε όλα τα άλλα στοιχειώδη στάδια δημιουργούνται γρήγορα) λέγεται ότι ικανοποιούν την υπόθεση της «γρήγορης ισορροπίας». Εάν, ωστόσο, το k 2 είναι συγκρίσιμο κατά σειρά μεγέθους με το k -1 , Η αλλαγή στη συγκέντρωση του συμπλόκου ενζύμου-υποστρώματος με την πάροδο του χρόνου μπορεί να εκφραστεί με την ακόλουθη διαφορική εξίσωση:

d / dt = k 1 [E] [S] - k -1 - k 2

Εφόσον εξετάζουμε τον αρχικό ρυθμό αντίδρασης, δηλ. τη στιγμή που η αντίστροφη αντίδραση δεν έχει ακόμη συμβεί και το στάδιο της προκαταρκτικής αγωγής έχει ήδη περάσει, τότε λόγω περίσσειας υποστρώματος, η ποσότητα του σχηματιζόμενου συμπλόκου ενζύμου-υποστρώματος είναι ίση με την ποσότητα του αποσαθρωμένου (αρχή της σταθερότητας, ή κινητική Briggs και Haldane, ή αρχή Bodenstein στη χημική κινητική) και είναι αλήθεια ότι

d/dt=0

Αντικαθιστώντας αυτό στη διαφορική εξίσωση, λαμβάνουμε την έκφραση για τη συγκέντρωση του ελεύθερου ενζύμου:

[E] = (k -1 + k 2) / k 1 [S]

[E] T = [E] + = [(k -1 + k 2) / k -1 [S] + 1] =

= (k -1 + k 2 + k -1 [S]) / k 1 [S]

Εξίσωση σταθερής κατάστασης:

K 1 [S] [E] T / (k -1 + k 2 + k 1 [S])

Επειδή v = k 2 , τότε το παίρνουμε

v = k 1 k 2 [S] [E] T / (k -1 + k 2 + k 1 [S]) = k 2 [S] [E] T / [(k -1 + k 2) / k 1 + [S]]

Σε αυτήν την περίπτωση

V max = k 2 [E] T

και είναι ίση με τη μέγιστη ταχύτητα που προκύπτει από την εξίσωση Michaelis-Menten. Ωστόσο, η σταθερά στον παρονομαστή της εξίσωσης Michaelis-Menten δεν είναι K S , εκείνοι. όχι η σταθερά διάστασης του συμπλόκου ενζύμου-υποστρώματος, αλλά η λεγόμενη Μιχάλης σταθερά:

K m = (k -1 + k 2) / k 1

Το K m ισούται με το K S μόνο αν .

Στην περίπτωση μιας σταθεράς στον παρονομαστή η εξίσωση της ταχύτητας εκφράζεται με τον τύπο

K k = k 2 / k 1

και ονομάζεται, σύμφωνα με τον Van Slyke, κινητική σταθερά.

Η εξίσωση σταθερής κατάστασης μπορεί επίσης να ληφθεί από τη διαφορική εξίσωση χωρίς την υπόθεση ότι d / dt = 0. Αν αντικαταστήσουμε την τιμή [E] = [E] T - στη διαφορική εξίσωση, μετά από μετασχηματισμούς λαμβάνουμε

= (k 1 [S] [E] T - d / dt) / (k 1 [S] + k -1 + k 2)

Για να ληφθεί η εξίσωση στατικής κατάστασης από αυτή την εξίσωση, δεν είναι απαραίτητο d / dt = 0. Αρκεί να ικανοποιηθεί η ανισότητα d / dt<< k 1 [S] [E] T . Этим объясняется, почему можно достичь хорошего приближения в течение длительного времени при использовании принципа стационарности.

Η διαφοροποιημένη εξίσωση σταθερής κατάστασης είναι η εξής:

d / dt = T / (k 1 [S] + k -1 + k 2) 2 ] (d [S] / dt)

Αυτή η έκφραση προφανώς δεν ισούται με 0.

1.2 Μετασχηματισμός της εξίσωσης Michaelis-Menten

Η αρχική εξίσωση Michaelis-Menten είναι μια εξίσωση υπερβολής, όπου μία από τις σταθερές (V max) είναι η ασύμπτωτη της καμπύλης. Μια άλλη σταθερά (K m), η αρνητική τιμή της οποίας προσδιορίζεται από τη δεύτερη ασύμπτωτη, είναι ίση με τη συγκέντρωση του υποστρώματος που απαιτείται για την επίτευξη V max / 2. Αυτό είναι εύκολο να επαληθευτεί, καθώς εάν

v=V max / 2, λοιπόν

V max / 2 = V max [S] / (K m + [S])

V max / V max = 1 = 2 [S] / (K m + [S]) m + [S] = 2 [S], δηλ. [S] = K m at v = V max /2.

Η εξίσωση Michaelis-Menten μπορεί να μετατραπεί αλγεβρικά σε άλλες μορφές που είναι πιο βολικές για τη γραφική αναπαράσταση των πειραματικών δεδομένων. Ένας από τους πιο συνηθισμένους μετασχηματισμούς καταλήγει απλώς στην εξίσωση των αντίστροφων της αριστερής και της δεξιάς πλευράς της εξίσωσης μεταξύ τους

Ως αποτέλεσμα του μετασχηματισμού λαμβάνουμε την έκφραση

η οποία ονομάζεται Εξισώσεις Lineweaver-Burk. Σύμφωνα με αυτή την εξίσωση, το γράφημα που παρουσιάζεται στις συντεταγμένες 1/[S] και 1/v είναι μια ευθεία γραμμή, η κλίση της οποίας είναι ίση με K m /V max και το τμήμα που αποκόπτεται στον άξονα τεταγμένων είναι ίσο με 1 /V μέγ. Ένα τέτοιο γράφημα, κατασκευασμένο με τη μέθοδο της διπλής αμοιβαίας, έχει το πλεονέκτημα ότι καθιστά δυνατό τον ακριβέστερο προσδιορισμό του V max. σε μια καμπύλη που απεικονίζεται στις συντεταγμένες [S] και v, το V max είναι μια ασυμπτωτική τιμή και προσδιορίζεται με πολύ μικρότερη ακρίβεια. Το τμήμα που αποκόπτεται στον άξονα x στο γράφημα Lineweaver-Burk είναι ίσο με -1/K m. Πολύτιμες πληροφορίες σχετικά με την αναστολή ενζύμων μπορούν επίσης να συλλεχθούν από αυτό το γράφημα.

Ένας άλλος μετασχηματισμός της εξίσωσης Michaelis-Menten είναι ότι και οι δύο πλευρές της εξίσωσης Lineweaver-Burk πολλαπλασιάζονται με V max *v και μετά από μερικούς επιπλέον μετασχηματισμούς παίρνουμε

Το αντίστοιχο γράφημα στις συντεταγμένες v και v/[S] αναπαριστά με ε 4, εικ. 1]. Ένα τέτοιο πρόγραμμα ( Διάγραμμα Edie-Hofstee) όχι μόνο καθιστά δυνατό τον πολύ απλό προσδιορισμό των τιμών των V max και Km, αλλά καθιστά επίσης δυνατό τον εντοπισμό πιθανών αποκλίσεων από τη γραμμικότητα που δεν ανιχνεύονται στο διάγραμμα Lineweaver-Burk.

Η εξίσωση μπορεί επίσης να γραμμικοποιηθεί με άλλη μορφή

[S] / v = K m / V max + [S] / V μέγ

Σε αυτήν την περίπτωση, η εξάρτηση του [S] / v από το [S] θα πρέπει να απεικονιστεί. Η κλίση της ευθείας που προκύπτει είναι 1/V max. τα τμήματα που αποκόπτονται στον άξονα τεταγμένης και τετμημένης είναι ίσα με (K m / V max) και (- K m), αντίστοιχα. Αυτό το γράφημα ονομάζεται από το όνομα του συγγραφέα. Διάγραμμα Haynes.

Η στατιστική ανάλυση έδειξε ότι οι μέθοδοι Edie-Hofstee και Haynes παρέχουν πιο ακριβή αποτελέσματα από τη μέθοδο Lineweaver-Burk. Ο λόγος για αυτό είναι ότι στα γραφήματα Edie-Hofstee και Haynes, τόσο εξαρτημένες όσο και ανεξάρτητες μεταβλητές περιλαμβάνονται στις ποσότητες που απεικονίζονται και στους δύο άξονες συντεταγμένων.

1.3 Επίδραση της συγκέντρωσης του υποστρώματος στην κινητική της αντίδρασης

Σε πολλές περιπτώσεις δεν πληρούται η προϋπόθεση της σταθερής συγκέντρωσης υποστρώματος. Από τη μία πλευρά, η περίσσεια του υποστρώματος δεν χρησιμοποιείται σε αντιδράσεις in vitro με ορισμένα ένζυμα λόγω της συχνά εμφανιζόμενης αναστολής της ενζυματικής δραστηριότητας του υποστρώματος. Σε αυτήν την περίπτωση, μπορεί να χρησιμοποιηθεί μόνο η βέλτιστη συγκέντρωσή του, και αυτό δεν παρέχει πάντα την περίσσεια υποστρώματος που είναι απαραίτητη για την εκπλήρωση των κινητικών εξισώσεων των μηχανισμών που συζητήθηκαν παραπάνω. Επιπλέον, σε ένα κύτταρο in vivo, η περίσσεια υποστρώματος που απαιτείται για να επιτευχθεί αυτή η κατάσταση συνήθως δεν επιτυγχάνεται.

Σε ενζυματικές αντιδράσεις, όπου το υπόστρωμα δεν είναι σε περίσσεια και, επομένως, η συγκέντρωσή του μεταβάλλεται κατά τη διάρκεια της αντίδρασης, η σταθερά διάστασης του συμπλόκου ενζύμου-υποστρώματος είναι ίση με

K S = ([S] 0 - - [P]) [E] T - )/

([S] 0 - συγκέντρωση υποστρώματος σε t = 0). Σε αυτή την περίπτωση, ο αρχικός ρυθμός αντίδρασης (σε σταθερή κατάσταση) καθορίζεται από τον τύπο

v= V max / (K m + )

πού είναι η συγκέντρωση του υποστρώματος κάθε φορά.

Ωστόσο, είναι δυνατόν να γράψουμε μια κατά προσέγγιση λύση για δύο περιπτώσεις όταν [S] o = :

) εάν αυτή η ανισότητα ισχύει λόγω μεγάλων τιμών του t, δηλ. όταν περισσότερο από το 5% της αρχικής συγκέντρωσης του υποστρώματος καταναλώνεται κατά τη διάρκεια της αντίδρασης.

) εάν η συγκέντρωση του ενζύμου δεν μπορεί να αγνοηθεί σε σύγκριση με τη συγκέντρωση του υποστρώματος και επομένως πρέπει να ληφθεί υπόψη η συγκέντρωση του συμπλόκου ενζύμου-υποστρώματος.

Εάν το t είναι μεγάλο και η συγκέντρωση είναι αμελητέα σε σύγκριση με το [S]0, τότε η εξίσωση για τη σταθερά διάστασης του συμπλόκου ενζύμου-υποστρώματος γίνεται η εξής:

K S = ([S] 0 - [P]) ([E] T - ) /

Για την τιμή συγκέντρωσης που μεταβάλλεται κατά την αντίδραση, μια ικανοποιητική προσέγγιση είναι η τιμή ([S] 0 + )/2. Αφού = [S] 0 - [P], μέση ταχύτητα; μπορεί να εκφραστεί ως

Αντικαθιστώντας αυτήν την έκφραση και την κατά προσέγγιση τιμή σε

v= V max / (K m +),

παίρνουμε:

Κατά τη σύγκριση των τιμών που υπολογίστηκαν από αυτήν την προσέγγιση με τις τιμές που προέκυψαν από την ακριβή, ολοκληρωμένη εξίσωση Michaelis-Menten, αποδεικνύεται ότι το σφάλμα στον προσδιορισμό του Km είναι 1 και 4% όταν καταναλώνεται το 30 και 50% του υποστρώματος, αντίστοιχα. Κατά συνέπεια, το σφάλμα σε αυτή την προσέγγιση είναι αμελητέο σε σύγκριση με το σφάλμα μέτρησης.

Όταν η κατανάλωση υποστρώματος δεν υπερβαίνει το 5% της αρχικής συγκέντρωσης, αλλά η συγκέντρωση του ενζύμου είναι τόσο υψηλή που σε σύγκριση με το [S] 0 δεν μπορεί να αγνοηθεί, η σταθερά διάστασης του συμπλέγματος ενζύμου-υποστρώματος είναι ίση με:

K s = ([S] 0 - ) ([E] T - ) /

Η λύση του δίνει σχετικά

Από τις δύο πιθανές λύσεις, μπορεί να επιλεγεί μόνο η αρνητική, αφού μόνο αυτή ικανοποιεί τις αρχικές συνθήκες: = 0 με [S] 0 = 0 ή [E] T = 0. Κατ' αναλογία με την εξίσωση του λόγου v/V max, λάβαμε την εξίσωση για την αρχική ταχύτητα. Η τετραγωνική εξίσωση που προκύπτει από την εξίσωση της σταθεράς διάστασης του συμπλόκου ενζύμου-υποστρώματος, που βρέθηκε ακριβώς παραπάνω, χρησιμοποιώντας τους τύπους v = k 2 και V max = k 2 [E] T, μπορεί να αναχθεί στην ακόλουθη μορφή:

[S] 0 V max / v = K s V max / (V max - v) + [E] T

Υπάρχουν δύο περιοριστικές περιπτώσεις που πρέπει να εξεταστούν. Στην πρώτη περίπτωση [S]<

v = (V max / K m) [S] = k[S]

Έτσι, έχουμε μια φαινομενική αντίδραση πρώτης τάξης και k=V max /K m - μια φαινομενική κινητική σταθερά πρώτης τάξης. Η πραγματική του διάσταση είναι ο χρόνος -1, αλλά είναι ένας συνδυασμός των σταθερών ρυθμού πρώτης και δεύτερης τάξης πολλών στοιχειωδών σταδίων, δηλ. k 1 k 2 [E] T / (k -1 + k 2) . Υπό προφανείς συνθήκες πρώτης τάξης k είναι ένα μέτρο της προόδου της αντίδρασης.

Μια άλλη ακραία περίπτωση: [S] >> Km. Εδώ η σταθερά K m είναι αμελητέα σε σύγκριση με το [S], και έτσι λαμβάνουμε v = V max.

1.4 Σχηματισμός ενός κινητικά σταθερού συμπλόκου ενζύμου-προϊόντος

Εάν κατά τη διάρκεια μιας αντίδρασης σχηματιστεί ένα κινητικά σταθερό σύμπλοκο ενζύμου-προϊόντος, ο μηχανισμός αντίδρασης είναι ο ακόλουθος:

Χρησιμοποιώντας την υπόθεση σταθερής κατάστασης, μπορούμε να γράψουμε τις διαφορικές εξισώσεις:

d /dt = k 1 [E] [S] + k -2 - (k -1 + k 2) = 0 /dt = k 2 - (k -2 + k 3) = 0

Από αυτές τις εξισώσεις προκύπτει ότι

= [(k -2 + k 3) / k 2 ]

[E] = [(k -1 k -2 + k -1 k -3 + k 2 k 3) / k 1 k 2 [S]]

Αφού v = k 3

και [E] T = [E] + + =

= [(k -1 k -2 + k -1 k -3 + k 2 k 3) / k 1 k 2 [S] + (k -2 + k 3) / k 2 + 1] =

= ( (k -2 + k 3) + k 1 k 2 [S]] / k 1 k 2 [S]

παίρνουμε

K 1 k 2 [S] [E] T / (k -2 + k 3 + k 2)] = k 1 k 2 k 3 [S] [E] T / (k -2 + k 3 + k 2) ] =

= [E] T [S] / [(k -1 k -2 + k -1 k -3 + k 2 k 3) / k 1 (k -2 + k 3 + k 2) + [S]]

Αυτό είναι

V max = [E] Tm = (k -1 k -2 + k -1 k -3 + k 2 k 3) / k 1 (k -2 + k 3 + k 2)

Σε αυτήν την περίπτωση, είναι ήδη πολύ δύσκολο να υπολογιστούν οι συγκεκριμένες τιμές των επιμέρους σταθερών ρυθμού, καθώς μόνο η αναλογία τους μπορεί να μετρηθεί άμεσα. Η κατάσταση γίνεται ακόμη πιο περίπλοκη όταν ο μηχανισμός μιας ενζυμικής αντίδρασης γίνεται πιο περίπλοκος, όταν εμπλέκονται περισσότερα από δύο σύμπλοκα στην αντίδραση, επειδή ο αριθμός των σταθερών ρυθμού στην εξίσωση είναι φυσικά πολύ μεγαλύτερος και οι σχέσεις τους είναι επίσης πιο σύνθετες.

Ωστόσο, η κατάσταση απλοποιείται εάν, μετά την αναστρέψιμη αντίδραση σχηματισμού του πρώτου συμπλέγματος, τα επόμενα στοιχειώδη στάδια είναι μη αναστρέψιμα. Σημαντικοί εκπρόσωποι των ενζύμων που υπακούουν σε αυτόν τον μηχανισμό είναι τα πρωτεολυτικά ένζυμα και οι εστεράσες. Ο μηχανισμός της αντίδρασής τους μπορεί να γραφτεί ως εξής:

όπου το ES» είναι ένα ενδιάμεσο ακυλένζυμο που αποσυντίθεται όταν εκτίθεται στο νερό. Μπορούμε να γράψουμε

V max = k 2 k 3 [E] 0 / (k 2 + k 3) = k cat [E] 0m = k 3 (k -1 + k 2) / (k 2 + k 3) k 1 γάτα / K m = k 2 k 1 / (k -1 + k 2) = k 2 / K m '

Η σταθερά Michaelis του σταδίου ακυλίωσης είναι Km "K s. Όσο μεγαλύτερη είναι η αναλογία k cat /K m, τόσο μεγαλύτερη είναι η ειδικότητα του υποστρώματος.

Ο προσδιορισμός των σταθερών απλοποιείται πολύ εάν το πείραμα διεξάγεται παρουσία πυρηνόφιλου παράγοντα (Ν) που μπορεί να ανταγωνιστεί το νερό. Επειτα

k 3 = k 3 ’ και P i (i = 1, 2, 3) είναι γινόμενα.

v i = k cat, i [S] / (K m + [S]) γάτα, 1 = k 2 (k 3 + k 4 [N]) / (k 2 + k 3 + k 4 [N]) γάτα, 2 = k 2 k 3 / (k 2 + k 3 + k 4 [N]) γάτα, 3 = k 2 k 4 [N] / (k 2 + k 3 + k 4 [N]) m = K s ( k 3 + k 4 [N]) / (k 2 + k 3 + k 4 [N])

/v N = K s (k 3 + k 4 [N]) / k 2 k 3 [S] + (k 2 + k 3 + k 4 [N]) / k 2 k 3

Δεδομένου ότι είναι γνωστό ότι K s / k 2 = K m / k γάτα, και αν δεν υπάρχει πυρηνόφιλο, τότε

1/v = K s / k 2 [S] + (k 2 + k 3) / k 2 k 3

και για να προσδιορίσετε τις σταθερές, μπορείτε να χρησιμοποιήσετε το σημείο τομής των ευθειών στις συντεταγμένες 1/v N (και 1/v) - 1/[S]. Δύο ευθείες σε διπλές αντίστροφες συντεταγμένες τέμνονται στο δεύτερο τεταρτημόριο. Ελλείψει πυρηνόφιλου, το σημείο τομής της ευθείας γραμμής με τον κατακόρυφο άξονα ορίζεται ως 1/V max και 1/k γάτα, και με τον οριζόντιο άξονα - ως -1/K m. Συντεταγμένες του σημείου τομής δύο ευθειών: -1/K s και 1/k 3. Η απόσταση μεταξύ 1/V max και 1/k 3 είναι 1/k 2 .

1.5 Ανάλυση της πλήρους κινητικής καμπύλης αντίδρασης

Η εξίσωση Michaelis-Menten στην αρχική της μορφή ισχύει μόνο για μη αναστρέψιμες αντιδράσεις, δηλ. σε αντιδράσεις όπου λαμβάνεται υπόψη μόνο ο αρχικός ρυθμός και η αντίστροφη αντίδραση δεν συμβαίνει λόγω ανεπαρκούς ποσότητας προϊόντος και δεν επηρεάζει την ταχύτητα αντίδρασης. Στην περίπτωση μιας μη αναστρέψιμης αντίδρασης, η πλήρης κινητική καμπύλη μπορεί εύκολα να αναλυθεί (για ένα αυθαίρετο χρονικό διάστημα t ), ενσωματώνοντας την αρχική εξίσωση Michaelis-Menten. Σε αυτή την περίπτωση, επομένως, παραμένει η υπόθεση ότι μόνο ένα ενδιάμεσο σύμπλοκο ενζύμου-υποστρώματος σχηματίζεται κατά τη διάρκεια της αντίδρασης. Δεδομένου ότι για το χρονικό διάστημα t δεν τίθενται περιορισμοί η συγκέντρωση του υποστρώματος τη στιγμή της ανάλυσης δεν μπορεί να είναι ίση με την αρχική του συγκέντρωση. Επομένως, η αλλαγή στο [S] κατά τη διάρκεια της αντίδρασης πρέπει επίσης να ληφθεί υπόψη. Έστω S 0 η αρχική συγκέντρωση του υποστρώματος, (S 0 - y ) - συγκέντρωση τη χρονική στιγμή t . Στη συνέχεια, με βάση την αρχική εξίσωση Michaelis - Menten (αν y - ποσότητα υποστρώματος που έχει μετατραπεί), μπορούμε να γράψουμε

dy / dt = V max (S 0 - y) / (K m +S 0 - y)

Παίρνοντας τα αντίστροφα και διαιρώντας τις μεταβλητές, ενσωματώνουμε πάνω από το y που κυμαίνεται από 0 έως y (Το V max ορίζεται ως V):

(2.303 / t) log = V / K m - (1 / K m) (y / t)

Έτσι, έχοντας σχεδιάσει την εξάρτηση της αριστερής πλευράς της εξίσωσης από το y/t (συντεταγμένες Foster-Niemann) , παίρνουμε μια ευθεία γραμμή με κλίση (-1/K m) , αποκοπή του τμήματος στον άξονα τεταγμένων (V/K m) , και στον άξονα x είναι το τμήμα V. Η ολοκληρωτική εξίσωση μπορεί επίσης να γραμμικοποιηθεί με άλλο τρόπο:

t / 2,3031 lg = y / 2,303 V lg + K m / V

ή t/y = 2,3031 K m lg / V y +1/V

Αν μελετάμε μια αναστρέψιμη αντίδραση, πρέπει να προσέξουμε με ποιο χρονικό διάστημα έχουμε να κάνουμε. Τη στιγμή της ανάμειξης του ενζύμου με το υπόστρωμα, ξεκινά η λεγόμενη προστατική φάση, που διαρκεί αρκετά μικρο- ή χιλιοστά του δευτερολέπτου, κατά την οποία σχηματίζονται σύμπλοκα ενζύμου-υποστρώματος που αντιστοιχούν στη στατική κατάσταση. Κατά τη μελέτη των αναστρέψιμων αντιδράσεων για αρκετά μεγάλα χρονικά διαστήματα, αυτή η φάση δεν παίζει σημαντικό ρόλο, αφού σε αυτή τη φάση η αντίδραση δεν προχωρά με πλήρη ταχύτητα προς οποιαδήποτε κατεύθυνση.

Για μια αντίδραση που προχωρά από αριστερά προς τα δεξιά, τα σύμπλοκα ενζύμου-υποστρώματος που συμμετέχουν στην αντίδραση φθάνουν στην περιοριστική συγκέντρωση του ρυθμού μόνο στο τέλος της προστατικής φάσης. Οιονεί στάσιμη κατάσταση, στις οποίες οι συγκεντρώσεις των συμπλεγμάτων ενζύμου-υποστρώματος που προσδιορίζουν το ρυθμό προσεγγίζουν τις μέγιστες τιμές συγκέντρωσης στη σταθερή κατάσταση, διαρκεί αρκετά δέκατα του δευτερολέπτου ή του δευτερολέπτου. Κατά τη διάρκεια αυτής της φάσης, ο ρυθμός σχηματισμού προϊόντος (ή κατανάλωσης υποστρώματος) είναι σχεδόν γραμμικός χρονικά. Θεωρητικά, ο σχηματισμός του προϊόντος δεν έχει συμβεί ακόμη, αλλά στην πράξη η συγκέντρωσή του είναι τόσο χαμηλή που ο ρυθμός της αντίστροφης αντίδρασης δεν επηρεάζει τον ρυθμό της προς τα εμπρός αντίδρασης. Αυτή η γραμμική φάση ονομάζεται αρχικός ρυθμός αντίδρασης και μέχρι στιγμής το έχουμε λάβει μόνο υπόψη μας.

Η αντίδραση από τα δεξιά προς τα αριστερά στην επόμενη φάση επιταχύνεται επίσης λόγω της σταδιακής αύξησης της συγκέντρωσης του προϊόντος (μεταβατικό στάδιο;η γραμμικότητα στο χρόνο που παρατηρήθηκε μέχρι τώρα εξαφανίζεται). Αυτή η φάση συνεχίζεται έως ότου ο ρυθμός αντίδρασης από αριστερά προς τα δεξιά γίνει ίσος με τον ρυθμό αντίδρασης από τα δεξιά προς τα αριστερά. Αυτό είναι ένα κράτος δυναμική ισορροπία,αφού η αντίδραση συνεχίζεται συνεχώς και προς τις δύο κατευθύνσεις με τον ίδιο ρυθμό.

2. Παράγοντες από τους οποίους εξαρτάται ο ρυθμός της ενζυμικής αντίδρασης

.1 Εξάρτηση του ρυθμού της ενζυμικής αντίδρασης από τη θερμοκρασία

Καθώς η θερμοκρασία του περιβάλλοντος αυξάνεται, ο ρυθμός της ενζυματικής αντίδρασης αυξάνεται, φτάνοντας στο μέγιστο σε κάποια βέλτιστη θερμοκρασία και στη συνέχεια πέφτει στο μηδέν. Για τις χημικές αντιδράσεις, υπάρχει ένας κανόνας ότι όταν η θερμοκρασία αυξάνεται κατά 10°C, ο ρυθμός αντίδρασης αυξάνεται δύο έως τρεις φορές. Για τις ενζυμικές αντιδράσεις, αυτός ο συντελεστής θερμοκρασίας είναι χαμηλότερος: για κάθε 10°C, ο ρυθμός αντίδρασης αυξάνεται κατά 2 φορές ή και λιγότερο. Η επακόλουθη μείωση του ρυθμού αντίδρασης στο μηδέν υποδηλώνει μετουσίωση του μπλοκ ενζύμου. Οι βέλτιστες τιμές θερμοκρασίας για τα περισσότερα ένζυμα είναι της τάξης των 20 - 40 0 ​​° C Η θερμοθερμοκρασία των ενζύμων σχετίζεται με τη δομή της πρωτεΐνης τους. Μερικά ένζυμα μετουσιώνονται ήδη σε θερμοκρασία περίπου 40 0 ​​C, αλλά το κύριο μέρος τους αδρανοποιείται σε θερμοκρασίες πάνω από 40 - 50 0 C. Ορισμένα ένζυμα απενεργοποιούνται από το κρύο, π.χ. σε θερμοκρασίες κοντά στους 0°C, συμβαίνει μετουσίωση.

Η αύξηση της θερμοκρασίας του σώματος (πυρετός) επιταχύνει τις βιοχημικές αντιδράσεις που καταλύονται από ένζυμα. Είναι εύκολο να υπολογίσουμε ότι κάθε βαθμός αύξησης της θερμοκρασίας του σώματος αυξάνει τον ρυθμό αντίδρασης κατά περίπου 20%. Σε υψηλές θερμοκρασίες περίπου 39-40°C, η άσκοπη χρήση ενδογενών υποστρωμάτων στα κύτταρα ενός άρρωστου οργανισμού πρέπει να αναπληρώνεται με τροφή. Επιπλέον, σε θερμοκρασία περίπου 40°C, ορισμένα πολύ θερμοευκίνητα ένζυμα μπορούν να μετουσιωθούν, γεγονός που διαταράσσει τη φυσική πορεία των βιοχημικών διεργασιών.

Η χαμηλή θερμοκρασία προκαλεί αναστρέψιμη αδρανοποίηση των ενζύμων λόγω μιας μικρής αλλαγής στη χωρική δομή του, αλλά επαρκής για να διαταράξει την κατάλληλη διαμόρφωση του ενεργού κέντρου και των μορίων του υποστρώματος.

2.2 Εξάρτηση του ρυθμού αντίδρασης από το pH του μέσου

Τα περισσότερα ένζυμα έχουν μια συγκεκριμένη τιμή pH στην οποία η δραστηριότητά τους είναι μεγαλύτερη. Πάνω και κάτω από αυτήν την τιμή pH, η δραστηριότητα αυτών των ενζύμων μειώνεται. Ωστόσο, δεν είναι σε όλες τις περιπτώσεις οι καμπύλες που περιγράφουν την εξάρτηση της ενζυμικής δραστηριότητας από το pH έχουν σχήμα καμπάνας. μερικές φορές αυτή η εξάρτηση μπορεί να εκφραστεί και άμεσα. Η εξάρτηση του ρυθμού μιας ενζυμικής αντίδρασης από το pH δείχνει κυρίως την κατάσταση των λειτουργικών ομάδων του ενεργού κέντρου του ενζύμου. Μια αλλαγή στο pH του μέσου επηρεάζει τον ιονισμό όξινων και βασικών ομάδων υπολειμμάτων αμινοξέων του ενεργού κέντρου, οι οποίες εμπλέκονται είτε στη δέσμευση του υποστρώματος (στη θέση επαφής) είτε στον μετασχηματισμό του (στην καταλυτική θέση ). Επομένως, η ειδική επίδραση του pH μπορεί να προκληθεί είτε από μια αλλαγή στη συγγένεια του υποστρώματος για το ένζυμο, είτε από μια αλλαγή στην καταλυτική δραστηριότητα του ενζύμου, είτε από και τους δύο λόγους μαζί.

Τα περισσότερα υποστρώματα έχουν όξινες ή βασικές ομάδες, επομένως το pH επηρεάζει τον βαθμό ιοντισμού του υποστρώματος. Το ένζυμο δεσμεύεται κατά προτίμηση είτε στην ιονισμένη είτε στη μη ιονισμένη μορφή του υποστρώματος. Προφανώς, σε βέλτιστο pH, οι λειτουργικές ομάδες της ενεργού θέσης βρίσκονται στην πιο δραστική κατάσταση και το υπόστρωμα είναι σε μια μορφή που προτιμάται για δέσμευση από αυτές τις ομάδες ενζύμων.

Κατά την κατασκευή καμπυλών που περιγράφουν την εξάρτηση της ενζυμικής δραστηριότητας από το pH, οι μετρήσεις σε όλες τις τιμές pH πραγματοποιούνται συνήθως υπό συνθήκες κορεσμού του ενζύμου με το υπόστρωμα, καθώς η τιμή Km για πολλά ένζυμα αλλάζει με τις αλλαγές στο pH.

Η καμπύλη που χαρακτηρίζει την εξάρτηση της ενζυμικής δραστηριότητας από το pH μπορεί να έχει ένα ιδιαίτερα απλό σχήμα σε περιπτώσεις όπου το ένζυμο δρα σε ηλεκτροστατικά ουδέτερα υποστρώματα ή υποστρώματα στα οποία οι φορτισμένες ομάδες δεν παίζουν σημαντικό ρόλο στην καταλυτική δράση. Ένα παράδειγμα τέτοιων ενζύμων είναι η παπαΐνη, καθώς και η ινβερτάση, η οποία καταλύει την υδρόλυση ουδέτερων μορίων σακχαρόζης και διατηρεί σταθερή δραστηριότητα στην περιοχή pH 3,0-7,5.

Η τιμή pH που αντιστοιχεί στη μέγιστη ενζυμική δραστηριότητα δεν συμπίπτει απαραίτητα με την τιμή pH που είναι χαρακτηριστική του φυσιολογικού ενδοκυτταρικού περιβάλλοντος αυτού του ενζύμου. Το τελευταίο μπορεί να είναι τόσο πάνω όσο και κάτω από το βέλτιστο pH. Αυτό υποδηλώνει ότι η επίδραση του pH στη δραστηριότητα του ενζύμου μπορεί να είναι ένας από τους παράγοντες που είναι υπεύθυνοι για τη ρύθμιση της ενζυματικής δραστηριότητας εντός του κυττάρου. Δεδομένου ότι το κύτταρο περιέχει εκατοντάδες ένζυμα και το καθένα από αυτά αντιδρά διαφορετικά στις αλλαγές του pH, η τιμή του pH μέσα στο κύτταρο είναι ίσως ένα από τα σημαντικά στοιχεία στο πολύπλοκο σύστημα ρύθμισης του κυτταρικού μεταβολισμού.

2.3 Προσδιορισμός της ποσότητας του ενζύμου από τη δράση του

) τη γενική στοιχειομετρία της καταλυόμενης αντίδρασης.

) πιθανή ανάγκη για συμπαράγοντες - μεταλλικά ιόντα ή συνένζυμα.

) εξάρτηση της ενζυμικής δραστηριότητας από τις συγκεντρώσεις υποστρώματος και συμπαράγοντα, δηλ. Τιμές Km τόσο για το υπόστρωμα όσο και για τον συμπαράγοντα.

) Τιμή pH που αντιστοιχεί στη μέγιστη ενζυμική δραστηριότητα.

) το εύρος θερμοκρασίας στο οποίο το ένζυμο είναι σταθερό και διατηρεί υψηλή δραστηριότητα.

Επιπλέον, είναι απαραίτητο να έχετε στη διάθεσή σας κάποια αρκετά απλή αναλυτική τεχνική που σας επιτρέπει να προσδιορίσετε τον ρυθμό εξαφάνισης του υποστρώματος ή τον ρυθμό εμφάνισης των προϊόντων αντίδρασης.

Όποτε είναι δυνατόν, οι δοκιμές ενζύμων πραγματοποιούνται υπό τυπικές συνθήκες που διατηρούν τις βέλτιστες συγκεντρώσεις pH και υποστρώματος πάνω από τη συγκέντρωση κορεσμού. Στην περίπτωση αυτή, ο αρχικός ρυθμός αντιστοιχεί σε μια αντίδραση μηδενικής τάξης σε σχέση με το υπόστρωμα και είναι ανάλογος μόνο με τη συγκέντρωση του ενζύμου. Για ένζυμα που απαιτούν συμπαράγοντες - ιόντα μετάλλων ή συνένζυμα, η συγκέντρωση αυτών των συμπαραγόντων πρέπει επίσης να υπερβαίνει τη συγκέντρωση κορεσμού, έτσι ώστε η συγκέντρωση του ενζύμου να είναι ο περιοριστικός παράγοντας ταχύτητας για την αντίδραση. Τυπικά, η μέτρηση του ρυθμού σχηματισμού προϊόντος μπορεί να γίνει με μεγαλύτερη ακρίβεια από τη μέτρηση του ρυθμού εξαφάνισης του υποστρώματος, καθώς το υπόστρωμα τυπικά πρέπει να υπάρχει σε σχετικά υψηλές συγκεντρώσεις για να διατηρείται η κινητική μηδενικής τάξης. Ο ρυθμός σχηματισμού του προϊόντος (ή των προϊόντων) της αντίδρασης μπορεί να μετρηθεί με χημικές ή φωτομετρικές μεθόδους. Η δεύτερη μέθοδος είναι πιο βολική, καθώς σας επιτρέπει να καταγράφετε συνεχώς την πρόοδο της αντίδρασης στη συσκευή εγγραφής.

Σύμφωνα με διεθνή συμφωνία, ως μονάδα ενζυματικής δραστηριότητας θεωρείται η ποσότητα ενζύμου που μπορεί να προκαλέσει τη μετατροπή ενός μικρογραμμομορίου υποστρώματος ανά λεπτό στους 25°C υπό βέλτιστες συνθήκες. Συγκεκριμένη δραστηριότηταένζυμο είναι ο αριθμός των μονάδων ενζυματικής δραστηριότητας ανά 1 mg πρωτεΐνης. Αυτή η τιμή χρησιμοποιείται ως κριτήριο για την καθαρότητα του παρασκευάσματος ενζύμου. αυξάνεται καθώς το ένζυμο καθαρίζεται και φτάνει στη μέγιστη τιμή του για ένα ιδανικά καθαρό παρασκεύασμα. Κάτω από αριθμός περιστροφώνκατανοούν τον αριθμό των μορίων του υποστρώματος που υφίστανται μετατροπή ανά μονάδα χρόνου ανά μόριο ενζύμου (ή ανά ενεργό κέντρο) υπό συνθήκες όπου ο ρυθμός αντίδρασης περιορίζεται από τη συγκέντρωση του ενζύμου.

2.4 Ενεργοποίηση ενζύμου

Η ρύθμιση των ενζύμων μπορεί να πραγματοποιηθεί μέσω της αλληλεπίδρασης με αυτά διαφόρων βιολογικών συστατικών ή ξένων ενώσεων (για παράδειγμα, φάρμακα και δηλητήρια), τα οποία συνήθως ονομάζονται τροποποιητέςή ρυθμιστικές αρχές ένζυμα.Υπό την επίδραση τροποποιητών στο ένζυμο, η αντίδραση μπορεί να επιταχυνθεί (ενεργοποιητές) ή να επιβραδυνθεί (αναστολείς).

Η ενεργοποίηση του ενζύμου καθορίζεται από την επιτάχυνση των βιοχημικών αντιδράσεων που συμβαίνει μετά τη δράση του τροποποιητή. Μια ομάδα ενεργοποιητών αποτελείται από ουσίες που επηρεάζουν την περιοχή του ενεργού κέντρου του ενζύμου. Αυτά περιλαμβάνουν ενζυμικούς συμπαράγοντες και υποστρώματα. Οι συμπαράγοντες (ιόντα μετάλλων και συνένζυμα) δεν είναι μόνο υποχρεωτικά δομικά στοιχεία σύνθετων ενζύμων, αλλά ουσιαστικά και οι ενεργοποιητές τους.

Τα μεταλλικά ιόντα είναι αρκετά συγκεκριμένοι ενεργοποιητές. Συχνά, ορισμένα ένζυμα απαιτούν ιόντα όχι ενός, αλλά πολλών μετάλλων. Για παράδειγμα, για το Na+, η K+-ATPase, η οποία μεταφέρει μονοσθενή κατιόντα μέσω της κυτταρικής μεμβράνης, χρειάζονται ιόντα μαγνησίου, νατρίου και καλίου ως ενεργοποιητές.

Η ενεργοποίηση με μεταλλικά ιόντα γίνεται μέσω διαφορετικών μηχανισμών. Σε ορισμένα ένζυμα αποτελούν μέρος της καταλυτικής θέσης. Σε ορισμένες περιπτώσεις, τα μεταλλικά ιόντα διευκολύνουν τη σύνδεση του υποστρώματος στο ενεργό κέντρο του ενζύμου, σχηματίζοντας ένα είδος γέφυρας. Συχνά το μέταλλο δεν συνδυάζεται με το ένζυμο, αλλά με το υπόστρωμα, σχηματίζοντας ένα σύμπλοκο μετάλλου-υποστρώματος, το οποίο είναι προτιμότερο για τη δράση του ενζύμου.

Η ειδικότητα της συμμετοχής των συνενζύμων στη δέσμευση και την κατάλυση του υποστρώματος εξηγεί την ενεργοποίηση των ενζυμικών αντιδράσεων τους. Η ενεργοποίηση των συμπαραγόντων είναι ιδιαίτερα αισθητή όταν δρουν σε ένα ένζυμο που δεν είναι κορεσμένο με συμπαράγοντες.

Το υπόστρωμα είναι επίσης ένας ενεργοποιητής εντός ορισμένων ορίων συγκέντρωσης. Μετά την επίτευξη των συγκεντρώσεων κορεσμού του υποστρώματος, η ενζυμική δραστηριότητα δεν αυξάνεται. Το υπόστρωμα αυξάνει τη σταθερότητα του ενζύμου και διευκολύνει το σχηματισμό της επιθυμητής διαμόρφωσης του ενεργού κέντρου του ενζύμου.

Μεταλλικά ιόντα, συνένζυμα και οι πρόδρομοι και τα ενεργά ανάλογα τους,

Τα υποστρώματα μπορούν να χρησιμοποιηθούν στην πράξη ως φάρμακα που ενεργοποιούν τα ένζυμα.

Η ενεργοποίηση ορισμένων ενζύμων μπορεί να πραγματοποιηθεί με τροποποιήσεις που δεν επηρεάζουν το ενεργό κέντρο των μορίων τους. Υπάρχουν πολλές επιλογές για αυτήν την τροποποίηση:

1) ενεργοποίηση ανενεργού προκατόχου - προένζυμο,ή ζυμογόνο. Για παράδειγμα, η μετατροπή του πεψινογόνου σε πεψίνη ;

2) ενεργοποίηση με σύνδεση οποιασδήποτε ειδικής τροποποιητικής ομάδας στο μόριο του ενζύμου.

3) ενεργοποίηση με διάσπαση του συμπλέγματος αδρανούς πρωτεϊνης ενεργού ενζύμου.

2.5 Αναστολή ενζύμου

Υπάρχουν αντιδραστήρια που μπορούν να αλληλεπιδράσουν περισσότερο ή λιγότερο συγκεκριμένα με τη μία ή την άλλη πλευρική αλυσίδα πρωτεϊνών, γεγονός που οδηγεί σε αναστολή της ενζυμικής δραστηριότητας. Αυτό το φαινόμενο καθιστά δυνατή τη μελέτη της φύσης των πλευρικών υπολειμμάτων αμινοξέων που εμπλέκονται σε αυτή την ενζυματική αντίδραση. Ωστόσο, στην πράξη, πρέπει να ληφθούν υπόψη πολλές λεπτές αποχρώσεις, γεγονός που καθιστά τη σαφή ερμηνεία των αποτελεσμάτων που λαμβάνονται με συγκεκριμένους αναστολείς αρκετά δύσκολη και συχνά αμφισβητήσιμη. Πρώτα απ 'όλα, για να είναι κατάλληλη μια αντίδραση με έναν αναστολέα για τη μελέτη της φύσης των πλευρικών αλυσίδων που εμπλέκονται στην αντίδραση, πρέπει να πληροί τα ακόλουθα κριτήρια:

) να είναι συγκεκριμένος, δηλ. ο αναστολέας πρέπει να μπλοκάρει μόνο τις επιθυμητές ομάδες.

) αναστέλλουν την ενζυμική δραστηριότητα και αυτή η αναστολή θα πρέπει να ολοκληρωθεί καθώς αυξάνεται ο αριθμός των τροποποιημένων ομάδων.

) το αντιδραστήριο δεν πρέπει να προκαλεί μη ειδική μετουσίωση της πρωτεΐνης.

Υπάρχουν 2 ομάδες αναστολέων: αναστρέψιμοι και μη αναστρέψιμοι. Η διαίρεση βασίζεται στο κριτήριο της αποκατάστασης της ενζυμικής δραστηριότητας μετά από αιμοκάθαρση ή ισχυρή αραίωση ενός ενζυμικού διαλύματος με έναν αναστολέα.

Σύμφωνα με τον μηχανισμό δράσης διακρίνονται η ανταγωνιστική, η μη ανταγωνιστική, η μη ανταγωνιστική, το υπόστρωμα και η αλλοστερική αναστολή.

Ανταγωνιστική αναστολή

Η ανταγωνιστική αναστολή ανακαλύφθηκε μελετώντας την αναστολή που προκαλείται από ανάλογα υποστρώματος. Αυτή είναι η αναστολή μιας ενζυμικής αντίδρασης που προκαλείται από τη δέσμευση στο ενεργό κέντρο του ενζύμου ενός αναστολέα παρόμοιου σε δομή με το υπόστρωμα και αποτρέποντας το σχηματισμό ενός συμπλόκου ενζύμου-υποστρώματος. Στην ανταγωνιστική αναστολή, ο αναστολέας και το υπόστρωμα, όντας παρόμοια στη δομή, ανταγωνίζονται για την ενεργό θέση του ενζύμου. Η ένωση των μορίων που είναι μεγαλύτερη σχετίζεται με το ενεργό κέντρο.

Τέτοιες ιδέες σχετικά με τον μηχανισμό της αναστολής επιβεβαιώθηκαν από πειράματα σχετικά με την κινητική των αντιδράσεων ανταγωνιστικής αναστολής. Έτσι, αποδείχθηκε ότι στην περίπτωση της ανταγωνιστικής αναστολής, το ανάλογο υποστρώματος δεν επηρεάζει τον ρυθμό αποσύνθεσης του ήδη σχηματισμένου συμπλόκου ενζύμου-υποστρώματος, δηλ. όταν χρησιμοποιείται μια «άπειρα μεγάλη» περίσσεια υποστρώματος, επιτυγχάνεται η ίδια μέγιστη ταχύτητα τόσο παρουσία όσο και απουσία του αναστολέα. Αντίθετα, ο αναστολέας επηρεάζει την τιμή της σταθεράς διάστασης και της σταθεράς Michaelis. Από αυτό μπορούμε να συμπεράνουμε ότι ο αναστολέας αντιδρά με πρωτεϊνικές ομάδες που εμπλέκονται με τον ένα ή τον άλλο τρόπο στη δέσμευση του υποστρώματος, επομένως, λόγω της αλληλεπίδρασής του με αυτές τις ομάδες, η ισχύς της δέσμευσης του υποστρώματος μειώνεται (δηλ. ο αριθμός των μορίων ενζύμου ικανό να δεσμεύει το υπόστρωμα μειώνεται) .

Αργότερα αποδείχθηκε ότι η κινητικά ανταγωνιστική αναστολή μπορεί να προκληθεί όχι μόνο από ανάλογα υποστρώματος, αλλά και από άλλα αντιδραστήρια των οποίων η χημική δομή είναι εντελώς διαφορετική από τη δομή του υποστρώματος. Σε αυτές τις περιπτώσεις, θεωρήθηκε επίσης ότι το αντιδραστήριο αλληλεπιδρά με την ομάδα που είναι υπεύθυνη για τη σύνδεση του υποστρώματος.

Για την ανταγωνιστική αναστολή, θεωρητικά υπάρχουν δύο δυνατότητες:

1) τα δεσμευτικά και καταλυτικά κέντρα του ενζύμου επικαλύπτονται. ο αναστολέας δεσμεύεται σε αυτά, αλλά επηρεάζει μόνο τις ομάδες του κέντρου δέσμευσης.

2) το κέντρο δέσμευσης και το καταλυτικό κέντρο στο μόριο του ενζύμου διαχωρίζονται χωρικά. ο αναστολέας αλληλεπιδρά με τη θέση δέσμευσης.

όπου το I είναι ένας αναστολέας και το ΚΙ είναι η σταθερά διάστασης του συμπλέγματος ενζύμου-αναστολέα.

Σχετικός ρυθμός (αναλογία του ρυθμού μιας ενζυμικής αντίδρασης που μετράται παρουσία ενός αναστολέα (v i) , στη μέγιστη ταχύτητα) ισούται με

v i / V = ​​· / [E] T

αφού για τη συνολική συγκέντρωση ενζύμου είναι αλήθεια

[E]T = [E] + +

τότε 1 / v i = (K s / V[S]) (1 + [I] / K I) + 1 / V

Προφανώς, αν [I] = K I , τότε η κλίση της ευθείας γίνεται διπλάσια από την εξάρτηση του 1/v 0 από το [S] (v 0 είναι ο ρυθμός της ενζυματικής αντίδρασης απουσία αναστολέα).

Ο τύπος της αναστολής καθορίζεται συνήθως γραφικά. Η ανταγωνιστική αναστολή αναγνωρίζεται πιο εύκολα με τη σχεδίαση γραφικών παραστάσεων Lineweaver-Burk (δηλαδή γραφικά σε συντεταγμένες 1/v i και 1/[S]) σε διαφορετικές συγκεντρώσεις αναστολέα. Με την πραγματική ανταγωνιστική αναστολή, λαμβάνεται ένα σύνολο ευθειών γραμμών, που διαφέρουν ως προς την εφαπτομένη της γωνίας κλίσης και τέμνουν τον άξονα τεταγμένων (άξονας 1/v i) σε ένα σημείο. Σε οποιαδήποτε συγκέντρωση αναστολέα, είναι δυνατή η χρήση τόσο υψηλής συγκέντρωσης υποστρώματος ώστε η ενζυμική δραστηριότητα να είναι μέγιστη.

Ένα παράδειγμα ανταγωνιστικής αναστολής είναι η επίδραση διαφόρων ουσιών στη δράση της ηλεκτρικής αφυδρογονάσης. Αυτό το ένζυμο είναι μέρος του κυκλικού ενζυμικού συστήματος - του κύκλου του Krebs. Το φυσικό του υπόστρωμα είναι το ηλεκτρικό και ένας παρόμοιος ανταγωνιστικός αναστολέας είναι το οξαλοξικό, ένα ενδιάμεσο προϊόν του ίδιου κύκλου Krebs:

Ένας παρόμοιος ανταγωνιστικός αναστολέας της ηλεκτρικής αφυδρογονάσης είναι το μηλονικό οξύ, το οποίο χρησιμοποιείται συχνά σε βιοχημικές μελέτες.

Η αρχή της ανταγωνιστικής αναστολής είναι η βάση για τη δράση πολλών φαρμακολογικών φαρμάκων, φυτοφαρμάκων που χρησιμοποιούνται για την καταστροφή γεωργικών παρασίτων και παραγόντων χημικού πολέμου.

Για παράδειγμα, μια ομάδα φαρμάκων αντιχολινεστεράσης, που περιλαμβάνει παράγωγα βάσεων τεταρτοταγούς αμμωνίου και οργανοφωσφορικών ενώσεων, είναι ανταγωνιστικοί αναστολείς του ενζύμου χολινεστεράσης σε σχέση με το υπόστρωμά του ακετυλοχολίνη. Η χολινεστεράση καταλύει την υδρόλυση της ακετυλοχολίνης, ενός μεσολαβητή των χολινεργικών συστημάτων (νευρομυϊκές συνάψεις, παρασυμπαθητικό σύστημα κ.λπ.). Οι ουσίες αντιχολινεστεράσης ανταγωνίζονται την ακετυλοχολίνη για τη δραστική θέση του ενζύμου, δεσμεύονται σε αυτήν και απενεργοποιούν την καταλυτική δράση του ενζύμου. Φάρμακα όπως η προζερίνη, η φυσοστιγμίνη, η σεβίνη αναστέλλουν το ένζυμο αναστρέψιμα και τα οργανοφωσφορικά φάρμακα όπως η αρμίνη, η νιβουφίνη, το χλωρόφος, το σομάν δρουν μη αναστρέψιμα, φωσφορυλιώνοντας την καταλυτική ομάδα του ενζύμου. Ως αποτέλεσμα της δράσης τους, η ακετυλοχολίνη συσσωρεύεται σε εκείνες τις συνάψεις όπου είναι μεσολαβητής της νευρικής διέγερσης, δηλ. το σώμα δηλητηριάζεται από τη συσσωρευμένη ακετυλοχολίνη. Η επίδραση των αναστρέψιμων αναστολέων σταδιακά εξασθενεί, καθώς όσο περισσότερη ακετυλοχολίνη συσσωρεύεται, τόσο πιο γρήγορα εκτοπίζει τον αναστολέα από το ενεργό κέντρο της χολινεστεράσης. Η τοξικότητα των μη αναστρέψιμων αναστολέων είναι ασύγκριτα υψηλότερη, επομένως χρησιμοποιούνται για τον έλεγχο γεωργικών παρασίτων, οικιακών εντόμων και τρωκτικών (για παράδειγμα, chlorophos) και ως παράγοντες χημικού πολέμου (για παράδειγμα, σαρίν, σομάν κ.λπ.).

Μη ανταγωνιστική αναστολή

Σε μη ανταγωνιστική αναστολή, ο ειδικός αναστολέας δεν επηρεάζει τη σταθερά διάστασης του συμπλόκου ενζύμου-υποστρώματος. Από την άλλη πλευρά, ο μέγιστος επιτεύξιμος ρυθμός αντίδρασης είναι χαμηλότερος παρουσία ενός αναστολέα από ό,τι απουσία του, ακόμη και με μια απείρως μεγάλη περίσσεια υποστρώματος. Η παρουσία αναστολής αποδεικνύει ότι ο αναστολέας συνδέεται με την πρωτεΐνη. Η αμετάβλητη της σταθεράς διάστασης τόσο παρουσία όσο και απουσία του αναστολέα, με τη σειρά του, δείχνει ότι, σε αντίθεση με το υπόστρωμα, ο αναστολέας συνδέεται με μια διαφορετική ομάδα. Από θεωρητική άποψη, ο μηχανισμός μιας τέτοιας αναστολής μπορεί να ερμηνευτεί με διάφορους τρόπους.

α) Το κέντρο δέσμευσης και το καταλυτικό κέντρο του ενζύμου είναι διαφορετικά. Σε αυτή την περίπτωση, ο αναστολέας που σχετίζεται με το καταλυτικό κέντρο μειώνει τη δραστηριότητα του ενζύμου και το μέγιστο που επιτυγχάνεται
ταχύτητα χωρίς να επηρεάζεται ο σχηματισμός του συμπλέγματος ενζύμου-υποστρώματος.

β) Το κέντρο δέσμευσης και το καταλυτικό κέντρο επικαλύπτονται κατά
επιφάνεια του ενζύμου και ο αναστολέας συνδέεται με άλλες ομάδες της πρωτεΐνης. Λόγω της δέσμευσης του αναστολέα στην επιφάνεια του ενζύμου, οι πληροφορίες πρωτεΐνης αλλάζουν και γίνονται δυσμενείς για κατάλυση.

γ) Ο αναστολέας δεν δεσμεύεται ούτε στην καταλυτική θέση ούτε στη θέση δέσμευσης και δεν επηρεάζει τη διαμόρφωση της πρωτεΐνης. Ωστόσο, μπορεί να αλλάξει τοπικά την κατανομή φορτίου σε μια περιοχή της επιφάνειας της πρωτεΐνης. Η αναστολή της δραστικότητας μπορεί επίσης να συμβεί σε αυτή την περίπτωση εάν, για παράδειγμα, ο ιονισμός των απαραίτητων ομάδων για την εκδήλωση της δραστηριότητας καταστεί αδύνατος, ή εάν, αντίθετα, ο ιονισμός των ομάδων ενεργών μόνο σε μη ιονισμένη μορφή λαμβάνει χώρα. Αυτό το φαινόμενο παρατηρείται κυρίως όταν χρησιμοποιούνται έντονα όξινα ή έντονα αλκαλικά αντιδραστήρια.

Ο αναστολέας και το υπόστρωμα δεν επηρεάζουν τη δέσμευση του άλλου με το ένζυμο, αλλά τα σύμπλοκα ενζύμων που περιέχουν τον αναστολέα είναι εντελώς ανενεργά. Σε αυτή την περίπτωση, μπορούμε να υποθέσουμε τα ακόλουθα στοιχειώδη στάδια:

v i / V = ​​· / [E] T

[E] T = [E] + + +

/ v i = (K s / V [S]) (1 + [I] / K I) + (1 / V) (1 + [I] / K I)

Αν [I] = K I οι κλίσεις των ευθειών και η τεταγμένη του σημείου τομής με τον κατακόρυφο άξονα διπλασιάζονται σε σύγκριση με 1/v 0.

Μη ανταγωνιστικοί αναστολείς είναι, για παράδειγμα, τα κυανίδια, τα οποία συνδέονται ισχυρά με τον σίδηρο σιδήρου, ο οποίος αποτελεί μέρος της καταλυτικής θέσης του ενζύμου αιμίνης - οξειδάση του κυτοχρώματος. Ο αποκλεισμός αυτού του ενζύμου απενεργοποιεί την αναπνευστική αλυσίδα και το κύτταρο πεθαίνει. Οι μη ανταγωνιστικοί αναστολείς ενζύμων περιλαμβάνουν ιόντα βαρέων μετάλλων και τις οργανικές ενώσεις τους. Επομένως, τα ιόντα βαρέων μετάλλων υδραργύρου, μολύβδου, καδμίου, αρσενικού και άλλων είναι πολύ τοξικά. Αποκλείουν, για παράδειγμα, ομάδες SH που περιλαμβάνονται στην καταλυτική θέση του ενζύμου.

Μη ανταγωνιστικοί αναστολείς είναι τα κυανίδια, τα οποία συνδέονται στενά με τον σίδηρο σιδήρου, ο οποίος αποτελεί μέρος της καταλυτικής θέσης του ενζύμου αιμίνης - οξειδάση του κυτοχρώματος. Ο αποκλεισμός αυτού του ενζύμου απενεργοποιεί την αναπνευστική αλυσίδα και το κύτταρο πεθαίνει. Είναι αδύνατο να αφαιρεθεί η επίδραση ενός μη ανταγωνιστικού αναστολέα με περίσσεια υποστρώματος (όπως η επίδραση ενός ανταγωνιστικού), αλλά μόνο με ουσίες που δεσμεύουν τον αναστολέα - επανενεργοποιητές.

Οι μη ανταγωνιστικοί αναστολείς χρησιμοποιούνται ως φαρμακολογικοί παράγοντες, δηλητηριώδεις ουσίες για τον έλεγχο των γεωργικών παρασίτων και για στρατιωτικούς σκοπούς. Στην ιατρική, χρησιμοποιούνται φάρμακα που περιέχουν υδράργυρο, αρσενικό και βισμούθιο, τα οποία αναστέλλουν μη ανταγωνιστικά ένζυμα στα κύτταρα του σώματος ή παθογόνα βακτήρια, τα οποία καθορίζουν τη μία ή την άλλη από τις επιδράσεις τους. Κατά τη διάρκεια της δηλητηρίασης, η δέσμευση του δηλητηρίου ή η μετατόπισή του από το σύμπλεγμα ενζύμου-αναστολέα είναι δυνατή με τη βοήθεια ενεργοποιητών. Αυτά περιλαμβάνουν όλα τα σύμπλοκα που περιέχουν SH (κυστεΐνη, διμερκαπτοπροπανόλη), κιτρικό οξύ, αιθυλενοδιαμινοτετραοξικό οξύ κ.λπ.

Μη ανταγωνιστική αναστολή

Αυτός ο τύπος αναστολής ονομάζεται επίσης αντιανταγωνιστικός στη βιβλιογραφία. ή σχετική αναστολή , Ωστόσο, ο όρος μη ανταγωνιστική αναστολή είναι ο πιο ευρέως χρησιμοποιούμενος. Το χαρακτηριστικό αυτού του τύπου αναστολής είναι ότι ο αναστολέας δεν μπορεί να συνδεθεί με το ένζυμο, αλλά δεσμεύεται στο σύμπλεγμα ενζύμου-υποστρώματος.

Στην περίπτωση μη ανταγωνιστικής αναστολής, το σύμπλοκο που περιέχει τον αναστολέα είναι ανενεργό:

v i / V = ​​· / [E]

[E] T = [E] + +

/ v i = K s / V[S] + (1 / V) (1 + [I] / K I)

Αναστολή υποστρώματος

Η αναστολή υποστρώματος είναι η αναστολή μιας ενζυμικής αντίδρασης που προκαλείται από περίσσεια υποστρώματος. Αυτή η αναστολή συμβαίνει λόγω του σχηματισμού ενός συμπλόκου ενζύμου-υποστρώματος που δεν είναι ικανό να υποστεί καταλυτικούς μετασχηματισμούς Το σύμπλοκο ES 2 είναι μη παραγωγικό και καθιστά το μόριο του ενζύμου ανενεργό. Η αναστολή του υποστρώματος προκαλείται από περίσσεια υποστρώματος και επομένως ανακουφίζεται όταν η συγκέντρωσή του μειώνεται.

Αλλοστερική αναστολή

Η αλλοστερική ρύθμιση είναι χαρακτηριστικό μόνο μιας ειδικής ομάδας ενζύμων με τεταρτοταγή δομή που έχουν ρυθμιστικά κέντρα για τη δέσμευση αλλοστερικών τελεστών. Οι αρνητικοί τελεστές που αναστέλλουν τη μετατροπή του υποστρώματος στην ενεργό θέση του ενζύμου δρουν ως αλλοστερικοί αναστολείς. Οι θετικοί αλλοστερικοί τελεστές, αντίθετα, επιταχύνουν την ενζυματική αντίδραση και επομένως ταξινομούνται ως αλλοστερικοί ενεργοποιητές. Οι αλλοστερικοί τελεστές των ενζύμων είναι συχνότερα διάφοροι μεταβολίτες, καθώς και ορμόνες, μεταλλικά ιόντα και συνένζυμα. Σε σπάνιες περιπτώσεις, ο ρόλος του αλλοστερικού τελεστή των ενζύμων εκτελείται από μόρια υποστρώματος.

Ο μηχανισμός δράσης των αλλοστερικών αναστολέων στο ένζυμο είναι η αλλαγή της διαμόρφωσης του ενεργού κέντρου. Η μείωση του ρυθμού μιας ενζυμικής αντίδρασης είναι είτε συνέπεια αύξησης του Km είτε αποτέλεσμα μείωσης του μέγιστου ρυθμού V max στις ίδιες συγκεντρώσεις κορεσμού του υποστρώματος, δηλ. το ένζυμο είναι μερικώς αδρανές.

Τα αλλοστερικά ένζυμα διαφέρουν από άλλα ένζυμα έχοντας μια ειδική καμπύλη σχήματος S της ταχύτητας αντίδρασης σε σχέση με τη συγκέντρωση του υποστρώματος. Αυτή η καμπύλη είναι παρόμοια με την καμπύλη κορεσμού οξυγόνου της αιμοσφαιρίνης, υποδηλώνει ότι τα ενεργά κέντρα των υπομονάδων δεν λειτουργούν αυτόνομα, αλλά συνεργατικά, δηλ. η συγγένεια κάθε επόμενου ενεργού κέντρου για το υπόστρωμα καθορίζεται από τον βαθμό κορεσμού των προηγούμενων κέντρων. Η συντονισμένη εργασία των κέντρων καθορίζεται από αλλοστερικούς τελεστές.

Η αλλοστερική ρύθμιση εκδηλώνεται με τη μορφή αναστολής από το τελικό προϊόν του πρώτου ενζύμου στην αλυσίδα. Η δομή του τελικού προϊόντος μετά από μια σειρά μετασχηματισμών της αρχικής ουσίας (υπόστρωμα) δεν είναι παρόμοια με το υπόστρωμα, επομένως το τελικό προϊόν μπορεί να δράσει στο αρχικό ένζυμο της αλυσίδας μόνο ως αλλοστερικός αναστολέας (ενεργός). Εξωτερικά, μια τέτοια ρύθμιση είναι παρόμοια με τη ρύθμιση μέσω ενός μηχανισμού ανάδρασης και σας επιτρέπει να ελέγχετε την απόδοση του τελικού προϊόντος, σε περίπτωση συσσώρευσης του οποίου η εργασία του πρώτου ενζύμου στην αλυσίδα σταματά. Για παράδειγμα, η ασπαρτική καρβαμοϋλοτρανσφεράση (ACTase) καταλύει την πρώτη από τις έξι αντιδράσεις στη σύνθεση της τριφωσφορικής κυτιδίνης (CTP). Το CTP είναι ένας αλλοστερικός αναστολέας της ΑΚΤάσης. Επομένως, όταν το CTP συσσωρεύεται, η AKTase αναστέλλεται και η περαιτέρω σύνθεση CTP σταματά. Έχει ανακαλυφθεί αλλοστερική ρύθμιση των ενζύμων από τις ορμόνες. Για παράδειγμα, τα οιστρογόνα είναι ένας αλλοστερικός αναστολέας του ενζύμου γλουταμική αφυδρογονάση, το οποίο καταλύει την απαμίνωση του γλουταμικού οξέος.

Έτσι, ακόμη και η απλούστερη κινητική εξίσωση μιας ενζυμικής αντίδρασης περιέχει πολλές κινητικές παραμέτρους, καθεμία από τις οποίες εξαρτάται από τη θερμοκρασία και το περιβάλλον στο οποίο συμβαίνει η αντίδραση.

Οι αναστολείς μας επιτρέπουν να κατανοήσουμε όχι μόνο την ουσία της ενζυματικής κατάλυσης, αλλά είναι επίσης ένα μοναδικό εργαλείο για τη μελέτη του ρόλου μεμονωμένων χημικών αντιδράσεων που μπορούν να απενεργοποιηθούν ειδικά χρησιμοποιώντας έναν αναστολέα ενός δεδομένου ενζύμου.

3. Ορισμένες συσκευές κατάλληλες για τον προσδιορισμό των αρχικών ρυθμών αντίδρασης

Πολλά προβλήματα ενζυματικής κινητικής οδηγούν στον προσδιορισμό των αρχικών ρυθμών αντίδρασης (v 0). Το κύριο πλεονέκτημα αυτής της μεθόδου είναι ότι οι τιμές του v 0 που προσδιορίζονται στην αρχική χρονική στιγμή θα δώσουν την πιο ακριβή αναπαράσταση της δραστηριότητας των ενζύμων που μελετώνται, καθώς τα προϊόντα αντίδρασης που συσσωρεύονται δεν έχουν ακόμη χρόνο να ασκήσουν ανασταλτική επίδραση στο ένζυμο και, επιπλέον, το σύστημα αντίδρασης βρίσκεται σε κατάσταση σταθερής ισορροπίας.

Στην εργαστηριακή πρακτική, ωστόσο, όταν χρησιμοποιούνται συμβατικές φασματοφωτομετρικές, τιτρομετρικές ή άλλες τεχνικές για την καταγραφή της προόδου τέτοιων αντιδράσεων, στην καλύτερη περίπτωση χάνονται έως και 15-20 από τον αρχικό χρόνο για την προσθήκη του ενζύμου στο υπόστρωμα, την ανάμειξη του συστήματος αντίδρασης, την εγκατάσταση το κελί κτλ. Και αυτό είναι απαράδεκτο, αφού η εφαπτομένη σε αυτή την περίπτωση φέρεται στο σημείο που tan ά 2< tg ά 1 . Не компенсируется потеря начального времени и при математической обработке таких кривых при записи выхода v 0 на максимальный уровень (V). Кроме того, протекание реакций без Η συνεχής ανάμιξη περιπλέκεται περαιτέρω από τις διακυμάνσεις στις συγκεντρώσεις των αντιδραστηρίων κατ' όγκο.

Οι απλές συσκευές που προτείνονται παρακάτω για ένα φασματοφωτόμετρο, pH μετρητή και παρόμοια μπορούν να μειώσουν σημαντικά τις πηγές των υποδεικνυόμενων σφαλμάτων στον προσδιορισμό του v 0.

3.1 Συσκευή για το φασματοφωτόμετρο

Η συσκευή φασματοφωτόμετρου αποτελείται από έναν διανομέα 1, ένα περιστρεφόμενο νήμα τεφλόν 2 (αναδευτήρας) και ένα καπάκι ασφάλισης 3.

Ο διανομέας είναι μια μικροσιφώνια, το ένα άκρο της οποίας έχει σχήμα με μια βελόνα 4, το άλλο με μια διεύρυνση 5 (για να αποτραπεί η είσοδος του ενζύμου στο ελαστικό άκρο 6).

Στο κάλυμμα από τεφλόν 3, που καλύπτει το φασματικό κελί 7, υπάρχουν δύο οπές: η μία (8) στο κέντρο του καλύμματος, η δεύτερη (9) πάνω από τη μέση του κενού μεταξύ του αδιαφανούς τοιχώματος του κελιού 7 και του φωτός δοκός 10. Σωλήνας τεφλόν 11 (εσωτερική διάμετρος 1 -1,5 mm) το ένα άκρο στερεώνεται στην οπή 9, το άλλο - σε μια σταθερή προεξοχή 12 μπροστά από τον ρότορα του κινητήρα 13. Το σπείρωμα 2 από τεφλόν εισάγεται στον σωλήνα (πάχος σπειρώματος 0,5 -0,6 mm). Το ένα άκρο του σπειρώματος στερεώνεται στον περιστρεφόμενο ρότορα του κινητήρα 13, το δεύτερο - περασμένο στην κυψελίδα 7 - διαμορφώνεται με τη μορφή σπειροειδούς (για ενίσχυση της ανάμειξης). Η θέση του νήματος καθορίζεται από το κάλυμμα ασφάλισης 3, ανεξάρτητα από την αφαίρεση του κινητήρα, το οποίο είναι βολικό για εργασίες που απαιτούν συχνές αλλαγές κυβετών.

Αρχή λειτουργίας.Η κυψελίδα χαλαζία του φασματοφωτόμετρου 7 είναι γεμάτη με υπόστρωμα 14 (περίπου 1,5-2,0 ml), εισάγεται στη θερμοστατική θήκη κυβέτας του φασματοφωτόμετρου, κλειστή με ένα καπάκι 3 με ένα περιστρεφόμενο νήμα τεφλόν 2, το οποίο είναι βυθισμένο στο υπόστρωμα14, και όλες οι περαιτέρω λειτουργίες εκτελούνται στη δέσμη φωτός του φασματοφωτόμετρου και καταγράφονται στον καταγραφέα.

Στην αρχή της εργασίας, το υπόστρωμα αναμειγνύεται και το στυλό εγγραφής γράφει μια ομοιόμορφη οριζόντια (ή «μηδενική») γραμμή. Ο διανομέας (με ένζυμο) εισάγεται στην οπή 8 (η βελόνα βυθίζεται στο διάλυμα υποστρώματος 14), πιέζοντας γρήγορα το άκρο 6, το ένζυμο (συνήθως περίπου 0,03-0,05 ml) εισάγεται στο υπόστρωμα και ο διανομέας αφαιρέθηκε. Η ανάμειξη των συστατικών τελειώνει σε 2,5-3 δευτερόλεπτα και η πένα καταγράφει την έναρξη της αντίδρασης με την απόκλιση της καμπύλης οπτικής πυκνότητας (ΔΑ) έναντι του χρόνου.

Αυτή η συσκευή καθιστά επίσης δυνατή τη λήψη δειγμάτων από το σύστημα αντίδρασης για ανάλυση. προσθέστε αναστολείς και ενεργοποιητές στο σύστημα. αλλάξτε τις συνθήκες αντίδρασης (αλλαγή pH, ιοντική ισχύς κ.λπ.) χωρίς να διαταράξετε την καταγραφή της προόδου της αντίδρασης, κάτι που αποδεικνύεται πολύ βολικό, για παράδειγμα, όταν μελετάτε τη διάσπαση n-NPF από «όξινες» φωσφατάσες, όπου η διάσπαση n-Το NFF πραγματοποιείται σε pH 5,0 (ή pH 6-7) και η ενζυμική δραστηριότητα προσδιορίζεται από τη συσσώρευση n-νιτροφαινολικά ιόντα σε ρΗ 9,5-10,0.

Μια τέτοια συσκευή είναι επίσης βολική για τη διεξαγωγή φασματοφωτομετρικής τιτλοδότησης ενζύμων κ.λπ.

3.2 Συσκευή για μετρητή pH

Η συσκευή για το μετρητή pH αποτελείται από ένα τροποποιημένο άκρο του ηλεκτροδίου ροής 1, ένα ημιμικροκύτταρο 2, έναν διανομέα 3 και ένα ηλεκτρονικό κύκλωμα για τη σύνδεση του μετρητή pH με τον καταγραφέα. Επιπλέον, η συσκευή περιλαμβάνει ένα τυπικό ηλεκτρόδιο μετρητή pH (4), ένα κάλυμμα υποδοχής κυψέλης (5), έναν θάλαμο θερμοστατικής ροής (6), ένα διάλυμα υποστρώματος (7), έναν παθητικό μαγνήτη (8) και έναν ενεργό μαγνήτη ( 9).

Η τυπική άκρη του ηλεκτροδίου ροής του μετρητή pH (LPU-01) αντικαθίσταται με σωλήνα τεφλόν 1 (εσωτερική διάμετρος 1,3-1,5 mm) και γεμίζεται με νήμα αμιάντου, προεπεξεργασμένο με κορεσμένο διάλυμα KCl. Η πυκνότητα πλήρωσης του νήματος ρυθμίζεται έτσι ώστε ο ρυθμός ροής του διαλύματος KCl μέσω του σωλήνα να είναι κοντά στον ρυθμό ροής του αρχικού μη τροποποιημένου ηλεκτροδίου. Αυτή η αντικατάσταση του άκρου καθιστά δυνατή τη μείωση του μεγέθους του αρχικού κυττάρου εργασίας από 20-25 σε 2 ml, γεγονός που καθιστά δυνατή τη χρήση ελάχιστων όγκων (1,5 ml) διαλυμάτων ακριβών βιοχημικών φαρμάκων.

Το ηλεκτρονικό κύκλωμα για τη σύνδεση του μετρητή pH (LPU-01) στη συσκευή εγγραφής αποτελείται από μια πηγή τροφοδοσίας (μπαταρία 12 V DC), μια εναλλασσόμενη αντίσταση καλωδίου R 1 (10 - 100 Ohms), η οποία ρυθμίζει μια τάση 9 V στο Δίοδος zener D809 σύμφωνα με την ένδειξη βολτόμετρου, μια εναλλασσόμενη αντίσταση καλωδίου R 2 (15-150 Ohm), η οποία ρυθμίζει τη ρύθμιση του «μηδέν» (σημείο αναφοράς) των ενδείξεων του μετρητή pH στην κλίμακα καταγραφής και μεταβλητή αντίσταση καλωδίου R 3 (35-500 Ohms), που ρυθμίζει την κλίμακα διαστολής (ενίσχυσης) των ενδείξεων της κλίμακας pH - μετρητές στη συσκευή εγγραφής. Το κύκλωμα λειτουργεί αξιόπιστα έως ότου η τάση της πηγής πέσει κάτω από τα 9 V.

Αρχή λειτουργίας. 1,5 ml υποστρώματος προστίθεται στην κυψέλη (γυάλινος κύλινδρος 1,7x2,4 cm) και η κυψέλη στερεώνεται στο καπάκι ασφάλισης 5. Η ανάδευση 9 είναι ενεργοποιημένη και η πένα καταγραφής γράφει μια ομοιόμορφη (βασική) γραμμή αναφοράς. Χρησιμοποιώντας έναν διανομέα, 0,03 ml του διαλύματος του ενζύμου προστίθενται στο υπόστρωμα και η πένα καταγράφει την έναρξη της αντίδρασης με την απόκλιση της καμπύλης pH έναντι χρόνου (t).

Μια τέτοια συσκευή δεν αντικαθιστά ένα στατιστικό pH, αλλά λαμβάνοντας υπόψη τη δυνατότητα επέκτασης της κλίμακας του μετρητή pH, σας επιτρέπει να καταγράφετε αξιόπιστα μικρές αλλαγές στο pH 0,004-0,005.

3.3 Χάρακες νομογράμματος, βολικοί για τον προσδιορισμό της αρχικής ταχύτητας

Σημαντική πολυπλοκότητα στον προσδιορισμό της αρχικής ταχύτητας στη μέθοδο της εφαπτομένης είναι ο υπολογισμός των αναλογιών μεταβολών στις συγκεντρώσεις των αντιδραστηρίων (Δ[S]) ανά μονάδα χρόνου (Δt), δηλ. έκφραση v 0 σε M/min από τις συνθήκες που

v 0 = lim Δ[S] / Δt, σε t 0.

Στην πράξη, μια τέτοια διαδικασία αποτελείται συνήθως από τρεις ή τέσσερις ξεχωριστές πράξεις: σχεδιάζεται μια εφαπτομένη στο αρχικό τμήμα της καμπύλης προόδου της αντίδρασης και, στη συνέχεια, ο αριθμός των μονάδων της καταγεγραμμένης τιμής (οπτική πυκνότητα, γωνία περιστροφής κ.λπ.) ανά μετράται ένα ορισμένο χρονικό διάστημα, και αυτό μεταφέρεται στη μονάδα του χρόνου και, τέλος, υπολογίζονται εκ νέου οι μετρήσεις του καταγραφέα για τη μεταβολή των συγκεντρώσεων του αντιδραστηρίου σε 1 λεπτό (M/min). Οι προτεινόμενοι δύο τύποι χάρακα νομογράμματος μας επιτρέπουν να απλοποιήσουμε αυτή τη διαδικασία.

Ορθογώνιος χάρακας. v 0 είναι ο λόγος Δ[S]/Δt, δηλ. tg ά, όπου ά είναι η γωνία κλίσης της εφαπτομένης στον άξονα του χρόνου t. Η ίδια εφαπτομένη είναι και η υποτείνουσα του αντίστοιχου ορθογωνίου τριγώνου με σκέλη [S] και αυτό. Όσο μεγαλύτερο v 0, τόσο πιο απότομη είναι η κλίση της εφαπτομένης. Κατά συνέπεια, αν περιοριστούμε σε ένα συγκεκριμένο χρονικό διάστημα, για παράδειγμα 1 λεπτό, θα πάρουμε μια σειρά από ορθογώνια τρίγωνα με διαφορετικές τιμές του σκέλους [S] (στην πραγματικότητα, διαφορετικές τιμές του v 0). Εάν βαθμονομήσετε και τα δύο σκέλη: οριζόντια - σε μονάδες χρόνου (1 λεπτό) και κατακόρυφα - σε μονάδες μεταβολής στις συγκεντρώσεις αντιδραστηρίου, για παράδειγμα σε χιλιοστά γραμμομόρια (mM), και εφαρμόσετε τα προκύπτοντα τμήματα σε κατάλληλη μορφή από διαφανές υλικό (πλεξιγκλάς πάχος περίπου 2 mm), τότε μπορείτε να πάρετε έναν βολικό χάρακα για τον προσδιορισμό των αρχικών ρυθμών αντίδρασης. Όλοι οι αριθμοί και οι γραμμές εφαρμόζονται στην πίσω πλευρά του χάρακα για την εξάλειψη των σφαλμάτων παράλλαξης κατά τον προσδιορισμό του v 0 .

Η διαδικασία για τον προσδιορισμό του v 0 μειώνεται σε αυτή την περίπτωση σε δύο απλές πράξεις: μια εφαπτομένη σύρεται στο αρχικό τμήμα της κινητικής καμπύλης t 2 και συνδυάστε το σημείο μηδέν του οριζόντιου σκέλους t του χάρακα με την αρχή της εφαπτομένης, η συνέχεια της εφαπτομένης θα τέμνει τώρα την κλίμακα συγκέντρωσης [S] στο σημείο που καθορίζει την τιμή v 0 σε M/min (με το οριζόντια θέση του ποδιού t on Δεν απαιτούνται πρόσθετες ενέργειες.

Χάρακας τόξου.Η διαδικασία για τον προσδιορισμό του v 0 μπορεί να απλοποιηθεί σε μία πράξη εάν η κλίμακα συγκέντρωσης σχεδιάζεται κατά μήκος ενός τόξου ορισμένης ακτίνας.

Μια ευθεία («βασική») γραμμή 2 εφαρμόζεται σε μια πλάκα από διαφανές υλικό (όλοι οι αριθμοί και οι γραμμές εφαρμόζονται επίσης στην πίσω πλευρά του χάρακα) και από το σημείο μηδέν (t=0, min) αυτής της γραμμής με ένα ακτίνα ίση με το μήκος του σκέλους t=1 min [ , σχεδιάστε ένα τόξο [S], από πάνω προς τα κάτω κατά μήκος του οποίου απεικονίζεται μια κλίμακα μεταβολών στις συγκεντρώσεις του αντιδραστηρίου (για παράδειγμα, υπόστρωμα σε mM).

Οι περιγραφόμενοι τύποι χάρακα, μια συσκευή για ένα φασματοφωτόμετρο και ένα pHόμετρο έχουν χρησιμοποιηθεί για πολλά χρόνια για τον προσδιορισμό των αρχικών ρυθμών αντιδράσεων (v 0), κατά τη μελέτη της εξειδίκευσης υποστρώματος των ενζύμων, για φασματοφωτομετρική τιτλοδότηση κ.λπ.

συμπέρασμα

Αυτή η εργασία εξέτασε τον κλάδο της ενζυμολογίας που μελετά την εξάρτηση του ρυθμού των χημικών αντιδράσεων που καταλύονται από τα ένζυμα από έναν αριθμό περιβαλλοντικών παραγόντων. Θεμελιωτές αυτής της επιστήμης θεωρούνται δικαίως ο Michaelis και ο Menten, οι οποίοι δημοσίευσαν τη θεωρία τους για τον γενικό μηχανισμό Ενζυματικές αντιδράσεις, έβγαλαν μια εξίσωση που έχει γίνει η θεμελιώδης αρχή όλων των κινητικών μελετών των ενζύμων και χρησιμεύει ως το σημείο εκκίνησης για κάθε ποσοτική περιγραφή της δράσης των ενζύμων. Η αρχική εξίσωση Michaelis-Menten είναι μια εξίσωση υπερβολής. Ο Lineweaver και ο Burke συνέβαλαν στην κινητική, οι οποίοι μεταμόρφωσαν την εξίσωση Michaelis-Menten και απέκτησαν ένα γράφημα μιας ευθείας γραμμής από την οποία μπορεί να προσδιοριστεί με μεγαλύτερη ακρίβεια η τιμή του V max.

Με την πάροδο του χρόνου, η αλλαγή στον ρυθμό μιας ενζυματικής αντίδρασης σε μια ενζυματική αντίδραση υπό πειραματικές συνθήκες μειώνεται. Μια μείωση της ταχύτητας μπορεί να συμβεί λόγω πολλών παραγόντων: μείωση της συγκέντρωσης του υποστρώματος, αύξηση της συγκέντρωσης του προϊόντος, η οποία μπορεί να έχει ανασταλτική δράση, αλλαγές στο pH του διαλύματος, αλλαγές στη θερμοκρασία του περιβάλλοντος μπορεί να συμβεί. Έτσι, με κάθε αύξηση της θερμοκρασίας κατά 10°C, ο ρυθμός αντίδρασης αυξάνεται κατά 2 φορές ή και λιγότερο. Η χαμηλή θερμοκρασία απενεργοποιεί αναστρέψιμα τα ένζυμα. Η εξάρτηση του ρυθμού μιας ενζυμικής αντίδρασης από το pH δείχνει την κατάσταση των λειτουργικών ομάδων του ενεργού κέντρου του ενζύμου. Κάθε ένζυμο ανταποκρίνεται διαφορετικά στις αλλαγές του pH. Οι χημικές αντιδράσεις μπορούν να σταματήσουν δρώντας σε αυτές με διάφορους τύπους αναστολής. Ο αρχικός ρυθμός αντίδρασης μπορεί να προσδιοριστεί γρήγορα και με ακρίβεια χρησιμοποιώντας συσκευές όπως χάρακες νομογράμματος, μια συσκευή για ένα φασματοφωτόμετρο και ένα μετρητή pH. Αυτό επιτρέπει την πιο ακριβή αναπαράσταση της δραστηριότητας των ενζύμων που μελετώνται.

Όλα αυτά χρησιμοποιούνται ενεργά σήμερα στην ιατρική πρακτική.

Κατάλογος πηγών που χρησιμοποιήθηκαν

1. Belyasova N.A. Βιοχημεία και μοριακή βιολογία. - Μν.: βιβλιοσπίτι, 2004. - 416 σ., εικ.

Keleti T. Fundamentals of enzymatic kinetics: Trans. από τα Αγγλικά - Μ.: Μιρ, 1990. -350 σ., εικ.

3. Knorre D.G. Βιολογική χημεία: Σχολικό βιβλίο. για τη χημεία, βιολ. και μέλι ειδικός. πανεπιστήμια - 3η έκδ., αναθ. - Μ.: Πιο ψηλά. σχολείο 2002. - 479 σελ.: ill.

4. Krupyanenko V.I. Μέθοδος φορέα για την αναπαράσταση ενζυματικών αντιδράσεων. - Μ.: Nauka, 1990. - 144 σελ.

5. Leninger A. Biochemistry. Μοριακή βάση κυτταρικής δομής και λειτουργίας: Trans. από τα Αγγλικά - Μ.: Μιρ, 1974.

6. Στρόεφ Ε.Α. Βιολογική χημεία: Εγχειρίδιο φαρμακευτικής. Ινστιτούτο και Φαρμακευτική. ψεύτικο. μέλι. Inst. - Μ.: Ανώτερη Σχολή, 1986. - 479 σ., εικ.

Ο Σεβερίν Ε.Σ. Βιοχημεία. ΕΝΑ. - 5η έκδ. - Μ.: GEOTAR - Media, 2009. - 786 σελ., εικ.

Ταχύτητα ενζυμικής αντίδρασης

Ο ρυθμός μιας ενζυμικής αντίδρασης μετράται από την ποσότητα του υποστρώματος που μετατρέπεται ανά μονάδα χρόνου ή την ποσότητα του προϊόντος που σχηματίζεται. Η ταχύτητα καθορίζεται από τη γωνία κλίσης της εφαπτομένης στην καμπύλη στο αρχικό στάδιο της αντίδρασης.

Ρύζι. 2 Ρυθμός ενζυματικής αντίδρασης.

Όσο πιο απότομη είναι η κλίση, τόσο μεγαλύτερη είναι η ταχύτητα. Με την πάροδο του χρόνου, ο ρυθμός αντίδρασης συνήθως μειώνεται, σε μεγάλο βαθμό ως αποτέλεσμα της μείωσης της συγκέντρωσης του υποστρώματος.

Παράγοντες που επηρεάζουν την ενζυματική δραστηριότητα

Η δράση του F. εξαρτάται από διάφορους παράγοντες: θερμοκρασία, περιβαλλοντική αντίδραση (pH), συγκέντρωση ενζύμου, συγκέντρωση υποστρώματος και παρουσία ειδικών ενεργοποιητών και μη ειδικών ή ειδικών αναστολέων.

Συγκέντρωση ενζύμου

Σε υψηλές συγκεντρώσεις υποστρώματος και σε άλλους παράγοντες που παραμένουν σταθεροί, ο ρυθμός της ενζυματικής αντίδρασης είναι ανάλογος της συγκέντρωσης του ενζύμου.

Ρύζι. 3 Εξάρτηση του ρυθμού της ενζυματικής αντίδρασης από τη συγκέντρωση του ενζύμου.

Η κατάλυση συμβαίνει πάντα υπό συνθήκες όπου η συγκέντρωση του ενζύμου είναι πολύ χαμηλότερη από τη συγκέντρωση του υποστρώματος. Επομένως, καθώς αυξάνεται η συγκέντρωση του ενζύμου, αυξάνεται και ο ρυθμός της ενζυματικής αντίδρασης.

Θερμοκρασία

Η επίδραση της θερμοκρασίας στον ρυθμό μιας ενζυμικής αντίδρασης μπορεί να εκφραστεί μέσω του συντελεστή θερμοκρασίας Q 10: Q 10 = (ταχύτητα αντίδρασης σε (x + 10) °C) / (ταχύτητα αντίδρασης σε x °C)

Μεταξύ 0-40°C, το Q10 μιας ενζυμικής αντίδρασης είναι 2. Με άλλα λόγια, για κάθε αύξηση της θερμοκρασίας κατά 10°C, ο ρυθμός της ενζυματικής αντίδρασης διπλασιάζεται.

Ρύζι. 4 Η επίδραση της θερμοκρασίας στη δραστηριότητα ενός ενζύμου όπως η αμυλάση του σάλιου.

Καθώς η θερμοκρασία αυξάνεται, η κίνηση των μορίων επιταχύνεται και τα μόρια των ουσιών που αντιδρούν είναι πιο πιθανό να συγκρουστούν μεταξύ τους. Κατά συνέπεια, αυξάνεται η πιθανότητα να υπάρξει αντίδραση μεταξύ τους. Η θερμοκρασία που παρέχει τη μεγαλύτερη δραστηριότητα ονομάζεται βέλτιστη. Πέρα από αυτό το επίπεδο, ο ρυθμός της ενζυμικής αντίδρασης μειώνεται, παρά την αύξηση της συχνότητας σύγκρουσης. Αυτό συμβαίνει λόγω της καταστροφής των δευτερογενών και τριτοταγών δομών του ενζύμου, με άλλα λόγια, λόγω του γεγονότος ότι το ένζυμο υφίσταται μετουσίωση.

Ρύζι. 5 Η πορεία της ενζυματικής αντίδρασης σε διαφορετικές θερμοκρασίες.

Όταν η θερμοκρασία πλησιάζει ή πέφτει κάτω από το μηδέν, τα ένζυμα αδρανοποιούνται, αλλά δεν συμβαίνει μετουσίωση. Με την αύξηση της θερμοκρασίας, η καταλυτική τους δραστηριότητα αποκαθίσταται και πάλι.

Δεδομένου ότι οι πρωτεΐνες σε ξηρή κατάσταση μετουσιώνονται πολύ πιο αργά από τις ενυδατωμένες πρωτεΐνες (με τη μορφή πρωτεϊνικής γέλης ή διαλύματος), η αδρανοποίηση του φωσφόρου σε ξηρή κατάσταση συμβαίνει πολύ πιο αργά από ό,τι με την παρουσία υγρασίας. Επομένως, τα ξηρά βακτηριακά σπόρια ή οι ξηροί σπόροι μπορούν να αντέξουν τη θέρμανση σε πολύ υψηλότερες θερμοκρασίες από τα ίδια σπόρια ή σπόροι σε υγρή κατάσταση.

Συγκέντρωση υποστρώματος

Για μια δεδομένη συγκέντρωση ενζύμου, ο ρυθμός της ενζυματικής αντίδρασης αυξάνεται με την αύξηση της συγκέντρωσης του υποστρώματος.

Ρύζι. 6 Εξάρτηση του ρυθμού της ενζυματικής αντίδρασης από τη συγκέντρωση του υποστρώματος.

Η θεωρητική μέγιστη ταχύτητα αντίδρασης V max δεν επιτυγχάνεται ποτέ, αλλά έρχεται ένα σημείο όπου μια περαιτέρω αύξηση στη συγκέντρωση του υποστρώματος δεν συνεπάγεται πλέον καμία αξιοσημείωτη αλλαγή στον ρυθμό αντίδρασης. Αυτό πρέπει να εξηγηθεί από το γεγονός ότι σε υψηλές συγκεντρώσεις υποστρώματος, τα ενεργά κέντρα των μορίων φωσφόρου είναι πρακτικά κορεσμένα σε κάθε δεδομένη στιγμή. Έτσι, ανεξάρτητα από το πόσο πλεονάζον υπόστρωμα είναι διαθέσιμο, μπορεί να συνδυαστεί με το ένζυμο μόνο αφού το σύμπλοκο ενζύμου-υποστρώματος που σχηματίστηκε προηγουμένως διασπαστεί σε προϊόν και σε ελεύθερο ένζυμο συγκέντρωση του υποστρώματος και ο χρόνος που απαιτείται για τη διάσταση του συμπλόκου ενζύμου-υποστρώματος.

Σε σταθερή θερμοκρασία, οποιοσδήποτε φώσφορος λειτουργεί πιο αποτελεσματικά σε ένα στενό εύρος pH. Η βέλτιστη τιμή pH είναι αυτή στην οποία η αντίδραση προχωρά με τη μέγιστη ταχύτητα.

Ρύζι. 7 Εξάρτηση της ενζυμικής δραστηριότητας από το pH.

Σε υψηλότερο και χαμηλότερο pH, η δραστηριότητα του F. μειώνεται. Η μετατόπιση του pH αλλάζει το φορτίο των ιονισμένων όξινων και βασικών ομάδων, από τις οποίες εξαρτάται το συγκεκριμένο σχήμα των μορίων του φωσφόρου Ως αποτέλεσμα, το σχήμα των μορίων του φωσφόρου αλλάζει και κυρίως το σχήμα του ενεργού κέντρου του. Εάν το pH αλλάξει πολύ απότομα, το F. μετουσιώνεται. Το βέλτιστο χαρακτηριστικό pH ενός δεδομένου φωσφόρου δεν συμπίπτει πάντα με το pH του άμεσου ενδοκυτταρικού του περιβάλλοντος. Αυτό υποδηλώνει ότι το περιβάλλον στο οποίο βρίσκεται ο Φ. ρυθμίζει σε κάποιο βαθμό τη δραστηριότητά του.

Σχεδόν όλες οι βιοχημικές αντιδράσεις είναι ενζυματικές. Ένζυμα(βιοκαταλύτες) είναι πρωτεϊνικές ουσίες που ενεργοποιούνται από μεταλλικά κατιόντα. Είναι γνωστά περίπου 2000 διαφορετικά ένζυμα και περίπου 150 από αυτά έχουν απομονωθεί, μερικά από τα οποία χρησιμοποιούνται ως φάρμακα. Η θρυψίνη και η χυμοθρυψίνη χρησιμοποιούνται για τη θεραπεία της βρογχίτιδας και της πνευμονίας. πεψίνη - για τη θεραπεία της γαστρίτιδας. πλασμίνη - για τη θεραπεία της καρδιακής προσβολής. Παγκρεατίνη – για τη θεραπεία του παγκρέατος. Τα ένζυμα διαφέρουν από τους συμβατικούς καταλύτες: (α) από την υψηλότερη καταλυτική δράση. (β) υψηλή ειδικότητα, δηλ. επιλεκτικότητα δράσης.

Ο μηχανισμός μιας ενζυματικής αντίδρασης ενός υποστρώματος μπορεί να αναπαρασταθεί από το ακόλουθο διάγραμμα:

όπου το Ε είναι ένα ένζυμο,

S - υπόστρωμα,

ES - σύμπλοκο ενζύμου-υποστρώματος,

Το P είναι το προϊόν της αντίδρασης.

Το χαρακτηριστικό του πρώτου σταδίου της ενζυμικής αντίδρασης είναι Σταθερά Michaelis (K M). Το K M είναι το αντίστροφο της σταθεράς ισορροπίας:

Η σταθερά Michaelis (K M) χαρακτηρίζει τη σταθερότητα του συμπλόκου ενζύμου-υποστρώματος (ES). Όσο χαμηλότερη είναι η σταθερά Michaelis (K M), τόσο πιο σταθερό είναι το σύμπλοκο.

Ο ρυθμός μιας ενζυμικής αντίδρασης είναι ίσος με τον ρυθμό του σταδίου περιορισμού της ταχύτητας:

όπου k 2 είναι η σταθερά του ρυθμού, που ονομάζεται αριθμός περιστροφώνή μοριακή δραστηριότητα του ενζύμου.

μοριακή ενζυμική δραστηριότητα(k 2) ισούται με τον αριθμό των μορίων του υποστρώματος που υφίστανται μετασχηματισμούς υπό την επίδραση ενός μορίου ενζύμου σε 1 λεπτό στους 25 0 C. Αυτή η σταθερά παίρνει τιμές στην περιοχή: 1·10 4< k 2 < 6·10 6 мин‾ 1 .

Για την ουρεάση, η οποία επιταχύνει την υδρόλυση της ουρίας, k 2 = 1,85∙10 6 min‾ 1; για την τριφωσφατάση αδενοσίνης, η οποία επιταχύνει την υδρόλυση του ATP, k 2 = 6,24∙10 6 min‾ 1; για την καταλάση, η οποία επιταχύνει την αποσύνθεση του H 2 O 2, k 2 = 5∙10 6 min‾ 1.

Ωστόσο, η κινητική εξίσωση της ενζυματικής αντίδρασης στη μορφή με την οποία δίνεται παραπάνω είναι πρακτικά αδύνατη να χρησιμοποιηθεί λόγω της αδυναμίας πειραματικού προσδιορισμού της συγκέντρωσης του συμπλόκου ενζύμου-υποστρώματος (). Εκφράζεται με όρους άλλων ποσοτήτων που προσδιορίζονται εύκολα πειραματικά, παίρνουμε την κινητική εξίσωση των ενζυματικών αντιδράσεων,που ονομάζεται από την εξίσωση Michaelis-Menten (1913):

,

όπου το γινόμενο k 2 [E] σύνολο είναι μια σταθερή τιμή, η οποία συμβολίζεται (μέγιστη ταχύτητα).

Αντίστοιχα:

Ας εξετάσουμε ειδικές περιπτώσεις της εξίσωσης Michaelis-Menten.

1) Σε χαμηλή συγκέντρωση υποστρώματος K M >> [S], επομένως

που αντιστοιχεί στην κινητική εξίσωση της αντίδρασης πρώτης τάξης.

2) Σε υψηλή συγκέντρωση υποστρώματος K m<< [S], поэтому

που αντιστοιχεί στην κινητική εξίσωση της αντίδρασης μηδενικής τάξης.

Έτσι, σε χαμηλή συγκέντρωση υποστρώματος, ο ρυθμός της ενζυματικής αντίδρασης αυξάνεται με την αύξηση της περιεκτικότητας του υποστρώματος στο σύστημα και σε υψηλή συγκέντρωση υποστρώματος, η κινητική καμπύλη φτάνει σε ένα επίπεδο (ο ρυθμός αντίδρασης δεν εξαρτάται από τη συγκέντρωση του υποστρώματος) (Εικ. 30).

Εικόνα 30. - Κινητική καμπύλη ενζυματικής αντίδρασης

Αν [S] = K M, τότε

που σας επιτρέπει να προσδιορίσετε γραφικά τη σταθερά Michaelis K m (Εικ. 31).

Εικόνα 31. - Γραφικός ορισμός της σταθεράς Michaelis

Η δραστηριότητα των ενζύμων επηρεάζεται από: (α) τη θερμοκρασία, (β) την οξύτητα του μέσου, (γ) την παρουσία αναστολέων. Η επίδραση της θερμοκρασίας στον ρυθμό μιας ενζυμικής αντίδρασης συζητείται στο Κεφάλαιο 9.3.

Η επίδραση της οξύτητας του μέσου στον ρυθμό της ενζυματικής αντίδρασης παρουσιάζεται στο Σχήμα 32. Η μέγιστη ενζυμική δραστηριότητα αντιστοιχεί στη βέλτιστη τιμή pH (pH opt).

Εικόνα 32. - Επίδραση της οξύτητας του διαλύματος στη δραστηριότητα του ενζύμου

Για τα περισσότερα ένζυμα, οι βέλτιστες τιμές pH συμπίπτουν με τις φυσιολογικές τιμές (7,3 - 7,4). Ωστόσο, υπάρχουν ένζυμα των οποίων η κανονική λειτουργία απαιτεί ένα έντονα όξινο (πεψίνη - 1,5 - 2,5) ή επαρκώς αλκαλικό περιβάλλον (αργινάση - 9,5 - 9,9).

Αναστολείς ενζύμων- πρόκειται για ουσίες που καταλαμβάνουν μέρος των ενεργών κέντρων των μορίων του ενζύμου, με αποτέλεσμα να μειώνεται ο ρυθμός της ενζυμικής αντίδρασης. Κατιόντα βαρέων μετάλλων, οργανικά οξέα και άλλες ενώσεις δρουν ως αναστολείς.

Διάλεξη 11

Ατομική δομή

Υπάρχουν δύο ορισμοί της έννοιας «άτομο». Ατομοείναι το μικρότερο σωματίδιο ενός χημικού στοιχείου που διατηρεί τις χημικές του ιδιότητες.

Ατομοείναι ένα ηλεκτρικά ουδέτερο μικροσύστημα που αποτελείται από έναν θετικά φορτισμένο πυρήνα και ένα αρνητικά φορτισμένο κέλυφος ηλεκτρονίων.

Το δόγμα του ατόμου έχει περάσει από μια μακρά πορεία ανάπτυξης. Τα κύρια στάδια στην ανάπτυξη του ατομισμού περιλαμβάνουν:

1) φυσικό φιλοσοφικό στάδιο - η περίοδος σχηματισμού της έννοιας της ατομικής δομής της ύλης, που δεν επιβεβαιώθηκε με πείραμα (5ος αιώνας π.Χ. - 16ος αιώνας μ.Χ.).

2) το στάδιο σχηματισμού της υπόθεσης για το άτομο ως το μικρότερο σωματίδιο ενός χημικού στοιχείου (XVIII-XIX αιώνες).

3) το στάδιο της δημιουργίας φυσικών μοντέλων που αντικατοπτρίζουν την πολυπλοκότητα της δομής του ατόμου και καθιστούν δυνατή την περιγραφή των ιδιοτήτων του (αρχές 20ου αιώνα)

4) το σύγχρονο στάδιο του ατομισμού ονομάζεται κβαντομηχανική. Κβαντική μηχανικήείναι κλάδος της φυσικής που μελετά την κίνηση των στοιχειωδών σωματιδίων.

ΣΧΕΔΙΟ

11.1. Δομή του πυρήνα. Ισότοπα.

11.2. Κβαντομηχανικό μοντέλο του ηλεκτρονιακού κελύφους ενός ατόμου.

11.3. Φυσικοχημικά χαρακτηριστικά ατόμων.

Δομή του πυρήνα. Ισότοπα

Ατομικός πυρήναςείναι ένα θετικά φορτισμένο σωματίδιο που αποτελείται από πρωτόνια, νετρόνια και κάποια άλλα στοιχειώδη σωματίδια.

Είναι γενικά αποδεκτό ότι τα κύρια στοιχειώδη σωματίδια του πυρήνα είναι τα πρωτόνια και τα νετρόνια. Πρωτόνιο (p) –είναι ένα στοιχειώδες σωματίδιο του οποίου η σχετική ατομική μάζα είναι 1 amu και το σχετικό φορτίο του είναι + 1. Νετρόνιο (n) –Αυτό είναι ένα στοιχειώδες σωματίδιο που δεν έχει ηλεκτρικό φορτίο και του οποίου η μάζα είναι ίση με τη μάζα ενός πρωτονίου.

Το 99,95% της μάζας ενός ατόμου συγκεντρώνεται στον πυρήνα. Ανάμεσα στα στοιχειώδη σωματίδια υπάρχουν ειδικές πυρηνικές δυνάμεις επέκτασης, οι οποίες υπερβαίνουν σημαντικά τις δυνάμεις της ηλεκτροστατικής απώθησης.

Το θεμελιώδες χαρακτηριστικό ενός ατόμου είναι χρέωσητου πυρήνες, ίσο με τον αριθμό των πρωτονίων και συμπίπτει με τον ατομικό αριθμό του στοιχείου στον περιοδικό πίνακα των χημικών στοιχείων. Ένα σύνολο (τύπος) ατόμων με το ίδιο πυρηνικό φορτίο ονομάζεται χημικό στοιχείο. Στοιχεία με αριθμούς από το 1 έως το 92 βρίσκονται στη φύση.

Ισότοπα- πρόκειται για άτομα του ίδιου χημικού στοιχείου που περιέχουν τον ίδιο αριθμό πρωτονίων και διαφορετικούς αριθμούς νετρονίων στον πυρήνα.

όπου ο μαζικός αριθμός (Α) είναι η μάζα του πυρήνα, z το φορτίο του πυρήνα.

Κάθε χημικό στοιχείο είναι ένα μείγμα ισοτόπων. Κατά κανόνα, το όνομα των ισοτόπων συμπίπτει με το όνομα του χημικού στοιχείου. Ωστόσο, έχουν εισαχθεί ειδικές ονομασίες για τα ισότοπα υδρογόνου. Το χημικό στοιχείο υδρογόνο αντιπροσωπεύεται από τρία ισότοπα:

Αριθμός p Αριθμός n

Protium N 1 0

Δευτέριο D 1 1

Τρίτιο T 1 2

Τα ισότοπα ενός χημικού στοιχείου μπορεί να είναι τόσο σταθερά όσο και ραδιενεργά. Τα ραδιενεργά ισότοπα περιέχουν πυρήνες που διασπώνται αυθόρμητα, απελευθερώνοντας σωματίδια και ενέργεια. Η σταθερότητα ενός πυρήνα καθορίζεται από την αναλογία νετρονίων-πρωτονίων.

Μόλις εισέλθουν στο σώμα, τα ραδιονουκλίδια διαταράσσουν τις πιο σημαντικές βιοχημικές διεργασίες, μειώνουν την ανοσία και καταδικάζουν το σώμα σε ασθένειες. Το σώμα προστατεύεται από τις επιπτώσεις της ακτινοβολίας απορροφώντας επιλεκτικά στοιχεία από το περιβάλλον. Τα σταθερά ισότοπα έχουν προτεραιότητα έναντι των ραδιενεργών ισοτόπων. Με άλλα λόγια, τα σταθερά ισότοπα εμποδίζουν τη συσσώρευση ραδιενεργών ισοτόπων σε ζωντανούς οργανισμούς (Πίνακας 8).

Το βιβλίο του S. Shannon «Nutrition in the Atomic Age» παρέχει τα ακόλουθα δεδομένα. Εάν ληφθεί μια ανασταλτική δόση ~ 100 mg σταθερού ισοτόπου ιωδίου το αργότερο 2 ώρες μετά την είσοδο του I-131 στο σώμα, η πρόσληψη ραδιοϊωδίου στον θυρεοειδή αδένα θα μειωθεί κατά 90%.

Τα ραδιοϊσότοπα χρησιμοποιούνται στην ιατρική

για τη διάγνωση ορισμένων ασθενειών,

· για τη θεραπεία όλων των μορφών καρκίνου,

· για παθοφυσιολογικές μελέτες.

Πίνακας 8 - Φαινόμενο αποκλεισμού σταθερών ισοτόπων

Οι γενικές αρχές της κινητικής των χημικών αντιδράσεων ισχύουν και για τις ενζυμικές αντιδράσεις. Με βάση μεγάλο αριθμό πειραματικών μελετών, διαπιστώθηκε ότι η εξάρτηση του ρυθμού της ενζυματικής διαδικασίας από τη συγκέντρωση του υποστρώματος γενικά μπορεί να αναπαρασταθεί από την καμπύλη που φαίνεται στο Σχ. 5.5.

Ρύζι. 5.5. Γενική άποψη της εξάρτησης του ρυθμού σταθερής κατάστασης μιας ενζυμικής αντίδρασης (v CT) από τη συγκέντρωση υποστρώματος ([S]) σε σταθερή συγκέντρωση ενζύμου:

ΕΝΑ- αντίδραση πρώτης τάξης (στα [S] Km ο ρυθμός αντίδρασης είναι ανάλογος της συγκέντρωσης του υποστρώματος). σι- αντίδραση μικτής τάξης. V -αντίδραση μηδενικής τάξης, όταν v ct ​​~ v max και ο ρυθμός αντίδρασης δεν εξαρτάται από τη συγκέντρωση του υποστρώματος

Σε χαμηλές συγκεντρώσεις υποστρώματος, η εξάρτηση του ρυθμού αντίδρασης σε σταθερή κατάσταση από τη συγκέντρωση του υποστρώματος (βλ. Εικ. 5.5, ενότητα ΕΝΑ)είναι κοντά στη γραμμική και υπακούει στην κινητική των αντιδράσεων πρώτης τάξης, δηλαδή ο ρυθμός αντίδρασης S -* P είναι ευθέως ανάλογος με τη συγκέντρωση του υποστρώματος S και ανά πάσα στιγμή tκαθορίζεται από την ακόλουθη κινητική εξίσωση: όπου [S] είναι η μοριακή συγκέντρωση του υποστρώματος S. - d[S]/d/ - ρυθμός απώλειας υποστρώματος. Προς τηνσταθερά του ρυθμού αντίδρασης, η οποία στην περίπτωση αυτή έχει μια διάσταση αντίστροφη προς τη μονάδα του χρόνου. Σε υψηλές συγκεντρώσεις υποστρώματος (τμήμα V)ο ρυθμός αντίδρασης είναι μέγιστος, σταθερός και ανεξάρτητος από τη συγκέντρωση του υποστρώματος [S]. Υπό αυτές τις συνθήκες, η αντίδραση υπακούει στην κινητική αντίδρασης μηδενικής τάξης v = k"και καθορίζεται εξ ολοκλήρου από τη συγκέντρωση του ενζύμου.

Σε αυτή την περίπτωση, εκδηλώνεται ένα σημαντικό χαρακτηριστικό των ενζυματικών αντιδράσεων - το φαινόμενο του κορεσμού του ενζύμου με το υπόστρωμα. Τοποθεσία ενεργοποιημένη σιο ρυθμός αντίδρασης είναι ανάλογος με το προϊόν των συγκεντρώσεων δύο αντιδρώντων ουσιών (υποστρώματος και ενζύμου), δηλαδή η αντίδραση προχωρά σύμφωνα με τους νόμους των αντιδράσεων δεύτερης τάξης. Από αυτό που φαίνεται στο Σχ. Το Σχήμα 5.5 δείχνει ότι μια αλλαγή στη συγκέντρωση του υποστρώματος στην περιοχή των χαμηλών τιμών επηρεάζει σημαντικά την ταχύτητα της διαδικασίας και σε υψηλές συγκεντρώσεις υποστρώματος αυτή η επίδραση είναι πολύ μικρή ή πρακτικά απουσιάζει. Σε χαμηλές συγκεντρώσεις υποστρώματος, ο ρυθμός αντίδρασης ελέγχεται από δύο παράγοντες: τον πραγματικό ρυθμό της καταλυόμενης από ένζυμο αντίδρασης και τη συχνότητα των συγκρούσεων μεταξύ του ενζύμου και του υποστρώματος. Καθώς η συγκέντρωση του υποστρώματος αυξάνεται, η συχνότητα σύγκρουσης παύει να είναι παράγοντας για τον προσδιορισμό του ρυθμού αντίδρασης.

Οι εξισώσεις κινητικής για διαδοχικές αντιδράσεις (5.5), (5.8), (5.9) ισχύουν επίσης για την κινητική των ενζυματικών αντιδράσεων, μια προσεκτική μελέτη των οποίων έχει δείξει ότι η γενική εμφάνιση των κινητικών καμπυλών κατανάλωσης υποστρώματος S έχει 5- διαμορφωμένη μορφή, τυπική για αντιδράσεις διαδοχικού μετασχηματισμού (Εικ. 5.6).

Ρύζι. 5.6.

Το I είναι η αρχική τομή (επαγωγική περίοδος), η οποία διαρκεί λιγότερο από ένα κλάσμα του δευτερολέπτου και καταλαμβάνει ένα μικρό μέρος του συνολικού χρόνου αντίδρασης. Εδώ η ταχύτητα αλλάζει από μηδέν σε v CT. II - σταθερό τμήμα. Σε αυτό το τμήμα, η ταχύτητα παραμένει περίπου σταθερή για αρκετά λεπτά. III είναι η κύρια περιοχή, η οποία αντιπροσωπεύει το μεγαλύτερο μέρος του χρόνου αντίδρασης. εδώ η ταχύτητα μειώνεται μονότονα

Αυτός ο τύπος καμπύλης κατανάλωσης υποστρώματος σύμφωνα με το μοντέλο που προτείνουν οι Michaelis και Menten εξηγείται από το σχηματισμό ενός ενδιάμεσου συμπλόκου στην ενζυματική διαδικασία: κατά την ενζυματική αντίδραση, το υπόστρωμα S σχηματίζει μια ένωση με το μόριο ενζύμου Ε - το ένζυμο-υπόστρωμα σύμπλοκο ES, το οποίο αποσυντίθεται προς δύο κατευθύνσεις. Κατά την αποσύνθεση κατά μήκος της πρώτης διαδρομής, το αρχικό μόριο του υποστρώματος S και του ενζύμου Ε σχηματίζεται ξανά Κατά την αποσύνθεση κατά μήκος της άλλης διαδρομής, σχηματίζεται ένα μόριο του προϊόντος P και το μόριο του ενζύμου αναγεννάται. Έτσι, ο μηχανισμός της ενζυματικής διαδικασίας (ενζυματική κατάλυση) περιγράφεται ως ένζυμο διαδοχικής αντίδρασης + σύμπλοκο υπόστρωμα ένζυμου-υποστρώματος - προϊόν + ένζυμο, στο οποίο το ένζυμο Ε συνδέεται με το υπόστρωμα S σε μια αναστρέψιμη αντίδραση (σταθερές ταχύτητας k, k 2)με το σχηματισμό του συμπλόκου ενζύμου-υποστρώματος ES. Το τελευταίο διασπάται σε μια αντίδραση με σταθερή ταχύτητα Az σε ένζυμο Ε και προϊόν P:

Πειραματικά στοιχεία του εξεταζόμενου μηχανισμού δράσης των ενζύμων λήφθηκαν για πρώτη φορά από τους L. Michaelis και M. Menten (1913), οι οποίοι δέχτηκαν ότι το ενδιάμεσο σύμπλεγμα ενζύμου-υποστρώματος ES σχηματίζεται αναστρέψιμα σύμφωνα με το νόμο της δράσης της μάζας:

Πίστευαν ότι ο ρυθμός διάσπασης του ES με το σχηματισμό του προϊόντος P είναι μικρός σε σύγκριση με τον ρυθμό ισορροπίας που καθορίζεται από Προς τηνΚαι έως 2.Με βάση αυτές τις υποθέσεις, προέκυψε μια εξίσωση, που ονομάστηκε από τους συγγραφείς εξίσωση Michaelis-Menten, που εκφράζει την ποσοτική σχέση μεταξύ της συγκέντρωσης του υποστρώματος και του ρυθμού σταθερής κατάστασης της ενζυμικής αντίδρασης:

όπου v max είναι ο μέγιστος ρυθμός αντίδρασης σε υψηλές συγκεντρώσεις υποστρώματος (βλ. Εικ. 5.6) και K m - Μιχάλης σταθερός,που είναι η σταθερά διάστασης του συμπλόκου ενζύμου-υποστρώματος στο ένζυμο και στο αρχικό υπόστρωμα. . ΣΕ

Το μοντέλο υποθέτει ότι το προϊόν δεν μπορεί να μετατραπεί ξανά στο υπόστρωμα (κάτι που ισχύει για τα αρχικά στάδια της αντίδρασης, όταν η συγκέντρωση του προϊόντος είναι χαμηλή). Δεδομένου ότι στο αρχικό στάδιο της αντίδρασης η συγκέντρωση του P είναι χαμηλή, η πιθανότητα αντίστροφης αντίδρασης του προϊόντος με το ένζυμο είναι απείρως μικρή και στη συνέχεια Προς την )καθορίζει την ταχύτητα της όλης διαδικασίας. Σε αυτή την περίπτωση, ο ρυθμός της ενζυμικής αντίδρασης v CT προσδιορίζεται ως ,

που επιβεβαιώνει την παρουσία ευθύγραμμου αρχικού τμήματος στο Σχ. 5.6.

Αυτό το μοντέλο αναπτύχθηκε στη συνέχεια λαμβάνοντας υπόψη το γεγονός ότι η συγκέντρωση του συμπλόκου ES ενζύμου-υποστρώματος μπορεί να μειωθεί με αξιοσημείωτο ρυθμό.

Στην εξίσωση Michaelis-Menten (5.12) οι τιμές v max, K mείναι σταθερές για ένα δεδομένο ένζυμο, αν και μπορούν να αλλάξουν ανεξάρτητα το ένα από το άλλο κάτω από διαφορετικές συνθήκες.

Αν [S]« ΠΡΟΣ ΤΗΝμ, λοιπόν

και η αντίδραση υπακούει σε μια εξίσωση πρώτης τάξης.

Στο [S] » K m

Αυτό σημαίνει ότι η αντίδραση δεν εξαρτάται από τη συγκέντρωση του υποστρώματος και προχωρά σύμφωνα με μια εξίσωση μηδενικής τάξης.

Στο K m= [S], g st = Vmax/2, δηλ. K mείναι αριθμητικά ίση με τη συγκέντρωση υποστρώματος [S], στην οποία ο ρυθμός αντίδρασης είναι το ήμισυ της μέγιστης τιμής. Αυτή η ισότητα μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον προσδιορισμό της σταθεράς Michaelis-Menten.

Η εξίσωση Michaelis-Menten (5.12) μπορεί να μετασχηματιστεί παρόμοια με τους μετασχηματισμούς Henderson-Hasselbach για τη διάσταση των ασθενών ηλεκτρολυτών:

ή

Ρύζι. 5.7.

Στο Σχ. Το σχήμα 5.7 δείχνει την κινητική καμπύλη μιας ενζυματικής αντίδρασης, που κατασκευάστηκε χρησιμοποιώντας την εξίσωση Michaelis-Menten, η οποία αντιπροσωπεύει μια υπερβολική εξάρτηση των ρυθμών σταθερής κατάστασης της καταλυόμενης από ένζυμο αντίδρασης από τη συγκέντρωση του υποστρώματος.

Για γραφικό ορισμό K mΗ εξίσωση (5.12) μπορεί να αναδιαταχθεί ως εξής:

από το οποίο ακολουθεί γραμμική εξάρτηση 1/v από 1/[S].

Οι G. Lineweaver και D. Burke ήταν οι πρώτοι που πρότειναν έναν τέτοιο μετασχηματισμό, οπότε η εξίσωση (5.13) και το γράφημα (Εικ. 5.8) φέρουν τα ονόματά τους. Εφαπτομένη της γωνίας κλίσης της ευθείας στο Σχ. 5,8 ισούται με την αναλογία

Ρύζι. 5.8.

K m/v max , η τιμή που παρεμποδίζεται στον άξονα 1/v αντιστοιχεί στην τιμή

Εάν σχεδιάσετε μια γραμμή στο γράφημα (βλ. Εικ. 5.8) μέχρι να τέμνεται με τον άξονα 1/[S], ​​τότε στο σημείο 1/v = O 1/[S] - -1/*m-

Έτσι, προσδιορίζοντας πειραματικά τον ρυθμό της διεργασίας σε τουλάχιστον δύο διαφορετικές συγκεντρώσεις υποστρώματος, μπορεί κανείς να λάβει τη σταθερά Στο μ.

Τα θεμέλια της κινητικής των ενζυμικών διεργασιών τέθηκαν στα έργα των Michaelis και Menten, ιδιαίτερα στην εξίσωση του συμπλέγματος ενζύμου-υποστρώματος.

Η κινητική των ενζυματικών διεργασιών νοείται ως κλάδος της επιστήμης των ενζύμων που μελετά την εξάρτηση του ρυθμού μιας ενζυματικής αντίδρασης από τη χημική φύση του υποστρώματος, τις περιβαλλοντικές συνθήκες, καθώς και από εξωτερικούς παράγοντες που επηρεάζουν την πορεία της αντίδρασης.
Όταν η συγκέντρωση του υποστρώματος είναι αρκετά υψηλή, δεν επηρεάζει πλέον τον ρυθμό, επειδή ο τελευταίος έχει γίνει μέγιστος (απόδειξη ότι ολόκληρο το ένζυμο συνδέεται με το υπόστρωμα).
Η μελέτη της ενζυμικής δραστηριότητας πραγματοποιείται σε υψηλές συγκεντρώσεις υποστρωμάτων (αντίδραση μηδενικής τάξης). Υπό αυτές τις συνθήκες, όλες οι αλλαγές στον ρυθμό αντίδρασης θα εξαρτηθούν μόνο από την ποσότητα του ενζύμου. Αλλά στα ζωντανά κύτταρα, οι συγκεντρώσεις του υποστρώματος συνήθως απέχουν πολύ από τον κορεσμό των ενζύμων. Αυτό σημαίνει ότι τα ένζυμα στα κύτταρα δεν χρησιμοποιούν την πλήρη ισχύ τους.
Εξάρτηση του ρυθμού της ενζυματικής αντίδρασης από την ποσότητα του ενζύμου
Εάν το υπόστρωμα είναι σε περίσσεια, κάτι που πρακτικά συμβαίνει σε πειραματικές συνθήκες, τότε ο ρυθμός αντίδρασης είναι ανάλογος της ποσότητας του ενζύμου. Αλλά, εάν η ποσότητα του ενζύμου αυξηθεί τόσο πολύ ώστε το υπόστρωμα να μην περισσεύει, τότε αυτή η αναλογικότητα θα παραβιαστεί.
Ο ρυθμός μιας ενζυμικής αντίδρασης αυξάνεται γραμμικά με την αύξηση της περιεκτικότητας σε ένζυμα. Αλλά μια υπερβολική αύξηση στη συγκέντρωση του ενζύμου οδηγεί στο γεγονός ότι υπάρχει λιγότερο υπόστρωμα από το ένζυμο και αυτό εκδηλώνεται με μείωση της αύξησης του ρυθμού αντίδρασης.
Επίδραση ρυθμιστών ενζύμου
Η δραστηριότητα των ενζύμων μπορεί να αλλάξει όχι μόνο λόγω αλλαγών στην ποσότητα του υποστρώματος, του ενζύμου και του pH του περιβάλλοντος, αλλά και υπό την επίδραση διαφόρων χημικών ουσιών. Οι ουσίες που επηρεάζουν την πορεία των ενζυματικών αντιδράσεων ονομάζονται ρυθμιστές ή τελεστές τους. Χωρίζονται σε ενεργοποιητές και αναστολείς, δηλαδή υπό την επιρροή τους η αντίδραση μπορεί να επιταχυνθεί ή να επιβραδυνθεί. Η μελέτη της δράσης των ρυθμιστών ενζύμων είναι πρακτικής σημασίας, καθώς μας επιτρέπει να κατανοήσουμε καλύτερα τη φύση της δράσης των ενζύμων. Μερικά από αυτά παίζουν το ρόλο των φυσικών ρυθμιστών του μεταβολισμού. Υπάρχουν πολλοί τύποι ρυθμιστών ενζυμικής δραστηριότητας, που διαφέρουν ως προς τη δομή και τον μηχανισμό δράσης.
ενεργοποιητές ενζύμων
Το ρόλο των ενεργοποιητών μπορούν να παίξουν τόσο οργανικές (χολικά οξέα, ένζυμα κ.λπ.) όσο και ανόργανες ουσίες (ιόντα μετάλλων, ανιόντα). Υπάρχουν συχνά περιπτώσεις όπου η ίδια ουσία είναι ενεργοποιητής σε σχέση με ένα ένζυμο και αναστολέας σε σχέση με ένα άλλο. Τα μεταλλικά ιόντα είναι πολύ συγκεκριμένοι ενεργοποιητές για ορισμένα ένζυμα. Μπορούν να διευκολύνουν την προσκόλληση ενός υποστρώματος στο ένζυμο, να συμμετέχουν στο σχηματισμό της τριτοταγούς δομής του ενζύμου ή να αποτελούν μέρος του ενεργού κέντρου. Τα ιόντα πολλών μετάλλων (νάτριο, κάλιο, ασβέστιο, μαγνήσιο, σίδηρος, χαλκός κ.λπ.) είναι απαραίτητα συστατικά που είναι απαραίτητα για τη φυσιολογική λειτουργία πολλών ενζύμων. Μερικές φορές ορισμένα ένζυμα απαιτούν πολλά διαφορετικά ιόντα. Για παράδειγμα, για την Na+, την K+-ATPase, η οποία μεταφέρει ιόντα μέσω της πλασματικής μεμβράνης, τα ιόντα καλίου, νατρίου και μαγνησίου είναι απαραίτητα για την κανονική λειτουργία.
Τα μέταλλα μπορεί να αποτελούν μέρος της προσθετικής ομάδας των ενζύμων. Για παράδειγμα, ο σίδηρος σε ενώσεις πορφυρίνης είναι απαραίτητο συστατικό των ενζύμων του συστήματος του κυτοχρώματος, της καταλάσης και της υπεροξειδάσης. Το κοβάλτιο περιλαμβάνεται στην προσθετική ομάδα των ενζύμων τρανσμεθυλάσης ομοκυστεΐνης και μεθυλμαλονυλ ισομεράσης. χαλκός - σε ασκορβική οξειδάση. Το μαγγάνιο είναι ένας ενεργοποιητής της ισοκιτρικής αφυδρογονάσης.
Μεταλλοένζυμα που περιέχουν κυρίως δι- και τρισθενή ιόντα σχηματίζουν χηλικές ενώσεις σε σχήμα νυχιών με υπολείμματα λειτουργικών ομάδων αμινοξέων και των αντίστοιχων ιόντων. Σε τέτοιες ενώσεις, τα ιόντα παρέχουν ένζυμα με μια ορισμένη χωρική δομή και συμβάλλουν στο σχηματισμό συμπλοκών ενζύμου-υποστρώματος. Μερικά ένζυμα απλά δεν παρουσιάζουν ενζυματική δράση απουσία μετάλλων. Για παράδειγμα, η καρβονική ανυδράση χωρίς ψευδάργυρο δεν έχει τις ιδιότητες ενός ενζύμου και η δράση του ψευδαργύρου δεν μπορεί να αντικατασταθεί από κανένα άλλο ιόν.
Υπάρχει μια ομάδα ενζύμων που ενεργοποιούνται από το cAMP. Τέτοια ένζυμα ονομάζονται πρωτεϊνικές κινάσες. Ο μηχανισμός ενεργοποίησής τους είναι ο εξής. Η πρωτεϊνική κινάση αποτελείται από δύο υπομονάδες: την καταλυτική υπομονάδα, η οποία περιέχει το ενεργό κέντρο και τη ρυθμιστική υπομονάδα, η οποία περιέχει τη θέση δέσμευσης cAMP. Το ένζυμο είναι ανενεργό επειδή η ενεργή του θέση είναι κλειστή. Απελευθερώνεται μόνο μέσω της αλληλεπίδρασης του c-AMP και του ρυθμιστικού κέντρου του ενζύμου.